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《灯盏花查尔酮合成酶基因表达和灯盏乙素含量关系探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、灯盏花查尔酮合成酶基因表达和灯盏乙素含量关系探究［摘要］目的：灯盏花的有效成分灯盏乙素是一种具有显著药理活性的黄酮类化合物，目前仍缺乏对其合成途径的相关认识。查尔酮合成酶(CHS)是黄酮类生物合成的一个关键酶，该研究旨在通过研究CHS表达水平与灯盏花中各组织灯盏乙素含量的变化规律，阐明该基因的表达模式与灯盏乙素含量之间的关系。方法：通过RT-PCR及RACE方法从灯盏花中克隆CHS基因全长，利用荧光定量PCR方法检测该基因在灯盏花各组织中的表达量，采用HPLC分析各组织中灯盏乙素的含量。结果：序列全长1270bp,编码405氨基酸，
2、该基因DNA序列与菊科植物的同源基因相似性在80%左右，荧光定量显示CHS在叶中表达量最高，远高于根、茎和花；HPLC发现灯盏乙素在叶中含量最高，其次是花和茎，而在根中未检测到。结论：相关性分析表明CHS相对表达量与灯盏花不同部位灯盏乙素含量间呈正相关关系(—0.761,P1.5灯盏花不同部位灯盏乙素含量测定Krosam订sC18色谱柱(4.6mmX250mm,5pm),参照药典采用的流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液(40:60),流速0.9mL•min-1,检测波长335nm,柱温30°C,进样量10uLo对照品溶液的制备参照药典制
3、备对照品溶液，用以建立灯盏乙素标准品的线性关系。样品待测液的制备参照2005年版药典中供试品溶液的制备过程。2结果2.1灯盏花全长CHS的克隆及特征分析对总RNA进行反转录成cDNA,进行PCR扩增，再用1%的琼脂糖电泳检测,获得约1000bp的条带，与目标片段大小相符。经过克隆测序，并采用内部片段设计反向引物进行卍RACE,克隆测序后经DNASTAR软件包拼接，获得CHS基因全长，序列长度为1237bpo与刘成洪已克隆测得的灯盏花CHS序列比对,一致性高达94.2%,不是同一个基因,因此，推测灯盏花中应该存在2个或2个以上的CHS
4、基因，属于同一基因家族,进一步印证了前人的基因组杂交实验结果。比对分析发现,其与菊科植物同源性较高（图1）。2.2灯盏花不同部位CHS的表达量分析与不同部位灯盏乙素含量的关系本研究通过对CHS和18SrRNA进行溶解曲线分析，查尔酮合成酶基因的溶解曲线呈现单峰、且出峰位置在退火温度处，据此可以初步确定发出荧光的片段是目标基因序列的扩增产物，即实验结果比较可靠。由此表明实验研究采用的荧光定量PCR引物能进行特异性扩增，能用于灯盏花CHS基因的荧光定量研究得到可靠的结果。以18SrRNA作为内参基因用实时荧光定量PCR检测各个部位的表达
5、情况，结果显示查尔酮合成酶基因在根、茎、叶、花4个部位都有表达，表达存在一定的差异性。从Threshold值，可初步得到在灯盏花中GOT-Ct值比较有根〉茎＞花＞叶(即29.548＞28.704＞25.852＞25.008)。因此灯盏花4个部位的平均表达量的关系为叶〉花＞茎＞根。CHS基因在茎中的相对表达量是根的2.55倍，花中表达量是茎的4.73倍，叶中表达量是花的6.15倍；且叶中表达量最高，远高于根和茎。将不同部位的CHS表达量(表1)与对应部位灯盏乙素含量作为2个变量，进行相关性分析，得出相关系数为(r=0.761,P[3]
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