人参皂苷re胶体金免疫检测试纸条制备和应用

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1、人参皂昔Re胶体金免疫检测试纸条制备和应用［摘要］利用胶体金标记的经饱和硫酸铁纯化的人参皂昔Re单克隆抗体、人参皂昔Re-牛血清白蛋白(GRe-BSA)、羊抗鼠IgG制备了人参皂昔Re胶体金免疫检测试纸条。该试纸条的最低检测极限为200Pg-L-lo检测时间10min。取10mg不同年份的人参样品分别用5mL自来水提取30min,分别用试纸条和酶联免疫检测法(indirectcompetitiveenzyme-linkedimmunosorbentassay,icELISA)检测。结果为：直接用试纸条测定上清液可区别真伪人参；上清液稀释100倍，用试纸条可区分出人参质量优劣。试纸条检测结果和

2、酶联免疫检测方法测定结果完全一致。所制备的胶体金免疫检测试纸条可以用于人参的快速真伪鉴别和质量优劣判断。［关键词］人参；单克隆抗体；试纸条［收稿日期］2013-03-06［通信作者］*王保民，教授，主要研究方向为免疫技术在植物研究上应用，Tel:(010)62732567,E-ma订：wbaomin@263.net人参是一种传统的名贵中药材，其药用历史在我国已有2000多年，常用于改善心血管系统和内分泌系统、促进代谢、抗肿瘤和抗氧化作用等［1-2］o人参皂昔是人参的主要有效成分之一，具有广泛的生物活性和医疗用途，其含量因药用部位、加工方法、栽培年限和产地而异。人参皂昔Re是人参皂昔中的重要单

3、体成分之一，也是人参中非常重要的活性物质之一，具有扩张血管、降低胆固醇含量、抗衰老以及促进CD4+T细胞增殖的作用［3］。目前，市场上中药造假泛滥，假冒和伪劣人参充斥市场，急需建立一种高效、灵敏的检测方法用于人参真伪快速鉴别和质量优劣判断。胶体金免疫检测试纸条已广泛应用于兽药残留［4］、农药残留［5］和中草药有效成分［6-7］等的现场快速检测。本研究拟利用已经制备好的人参皂昔Re单克隆抗体，通过与胶体金的标记制备免疫检测试纸条并用于人参的现场快速筛选。1材料人参皂昔Re（ginsenosideRe,GRe）（中国食品药品检定研究院），人参皂＜Re单克隆抗体和人参皂昔Re-BSA联结物由本室制

4、备，其中抗体为IgGl,轻链为k型。与人参皂昔Rgl,Rd,Rf的交叉反应率分别为89.6%,2.8%,2.6%。牛血清白蛋白（BSA）、羊抗鼠IgG为Sigma公司产品。样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫、底版、20nm胶体金溶液（未标记）等均为上海杰一生物技术有限公司产品。多年生栽培人参采自吉林省抚松县，由吉林省农业科学院李刚研究员惠赠。包被缓冲液：0.05mol•L-1碳酸盐缓冲液(pH9.6)；PB：0.01mol-L-1磷酸盐缓冲液(pH7.5)；PBS：含0.9%NaCl的0.1mol•L-1磷酸盐缓冲液(pH7.5)；洗液(PBST):含有0.1%聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(吐温

5、-20)的PBS；样品稀释液(PBSTG)：含有0.5%明胶的PBST；TMB显色溶液购自美国Sigma公司；终止液：1mol•L~1HC1O台式划膜喷金一体机、切膜机均为上海杰一生物技术有限公司产品。2方法2.1抗体的纯化采用饱和硫酸铁沉淀法对小鼠腹水进行纯化[8],0.01mol・L-1pH7.4的PB充分透析后再用蒸馆水透析2次除去硫酸鞍。纯化后的抗体冷冻干燥，-20°C保存。使用前用0.01mol•L-1pH7.4的PB溶解。2.2胶体金的标记用0.1mol•L-1的K2C03和0.1mol•L-1的HC1调节胶体金溶液至pH8.2o取抗体溶液，用0.01mol•L-1pH7.4PB

6、将抗体稀释至1mL,逐滴加入到20mL胶体金溶液中，使其最终质量浓度为2.0mg•L-1,继续搅拌45min。加入10%的BSA溶液使其最终浓度为0.5%,继续搅拌60min。5000Xg离心30min,除去上清液，将沉淀悬浮于1mL的含0.5%BSA和0.05%叠氮化钠的0.01mol•L-1pH7.4PB中，置4£下保存。2.3胶体金免疫检测试纸条的调试与制备用台式划膜喷金一体机分别在NC膜和金标垫上喷不同浓度的人参皂昔Re-BSA联结物、羊抗鼠IgG和胶体金标记抗体，分别组装试纸条。检测不同浓度的人参皂昔Re标样和空白对照样品，通过观察检测线和对照线筛选人参皂昔Re-BSA联结物和胶体

7、金标记抗体的最佳浓度。最佳条件为0.5mg・L-1的人参皂昔Re-BSA联结物、2mg・L-1羊抗鼠IgG用台式划膜喷金一体机微定量喷头在NC膜上每厘米喷1uLo制备好的胶体金标记抗体稀释1倍后，将胶体金标记物喷于胶体金释放垫上，喷样量为每厘米喷3uLo2.4试纸条检测限的确定用自来水将人参皂昔Re对照品稀释为不同浓度，以水或PBS作为对照，用试纸条进行检测，根据检测线的颜色深浅来判定试纸条的检测范围。2.5