罗格列酮抑制糖基化终产物诱导的人肾小球系膜细.doc.doc

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1、罗格列酮抑制糖基化终产物诱导的人肾小球系膜细胞正常T细胞表达分泌的调节活化蛋白表达增加周莉，马丽，孙子林*东南大学附属中大医院内分泌科，南京（210009）E-mail：manman_zl@126.com摘要：目的探讨糖基化终产物(AGEs)对体外培养的人肾系膜细胞(HRMC)趋化因子—正常T细胞表达分泌的调节活化蛋白(RANTES)基因和蛋白表达的影响以及罗格列酮的干预效应。方法运用糖基化修饰的牛血清白蛋白（AGE-BSA）加或不加罗格列酮干预体外培养的HRMC，用半定量RT-PCR检测细胞中RANTESmRNA水

2、平，用Westernblot和ELISA法分别测定细胞裂解物和培养上清中RANTES蛋白水平。结果（1）AGE-BSA呈浓度和时间依赖性增加人肾系膜细胞RANTESmRNA和蛋白表达；（2）罗格列酮呈浓度依赖性降低AGE-BSA刺激的人肾系膜细胞RANTESmRNA和蛋白的表达。结论罗格列酮能抑制糖基化终产物诱导的人肾系膜细胞RANTES的表达和分泌。关键词：糖基化终产物；正常T细胞表达分泌的调节活化蛋白；人肾系膜细胞糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）是糖尿病（diabetesmellitus

3、,DM）严重的微血管并发症之一，是导致终末期肾脏疾病最常见的原因[1]。近来诸多研究表明，DN肾脏损害的实质是炎症反应，而趋化因子在此反应过程中扮演着不容忽视的角色[2]。正常T细胞表达分泌的调节活化蛋白（regulateduponactivation,normalTcellexpressedandsecreted,RANTES）是趋化因子CC亚家族的成员之一，本实验拟用体外制备的AGEs作用于人肾系膜细胞（humanrenalmesangialcell,HRMC）并用罗格列酮进行干预，观察AGEs对HRMC的RAN

4、TES基因和蛋白表达的影响及罗格列酮的干预效应，为阐明DN的发病机制及罗格列酮的临床应用提供新的实验依据。1.材料和方法1.1.材料1.1.1细胞株人肾系膜细胞（HRMC）株，由阮雄中博士（RenalUnit，RoyalFreeHospital，LONDON，UK）惠赠。1.1.2试剂牛血清白蛋白(BSA，AMRESCO)，DMEM培养基（GIBCO，U.S.A.低糖），新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，Hepes(上海丽珠东风生物技术有限公司)，Trizol（Sangon产品），M-MLV逆转录酶（Pr

5、omega产品），TaqDNA聚合酶（Promega产品），dNTPs（Sangon产品），RNasin（SABC产品），Oligo（DT）18（Sangon产品），DNAladder（华美公司产品），RANTES及β-actin引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成。人RANTES96孔ELISA试剂盒（法国Immunotech产品）。其他试剂均为国产分析纯。1.1.3仪器和器材CO2恒温培养箱(NAPCO)，基因扩增仪(BIO-RAD)，SCR-300电泳仪(上海万达生物工程公司)，紫外检测仪（天能科技有限公司），

6、洗板机(Model1575，BIO-RAD产品)，酶标仪-8-(Model550，BIO-RAD产品)。1.2.方法1.2.1AGEs-BSA的制备在pH7.4的PBS溶液里加入牛血清白蛋白（BSA），使浓度为5.0g·L-1，然后加入一定量葡萄糖使其终浓度分别为0、20、50、80mmol·L-1，过滤除菌后37℃无菌孵育。使用前以pH7.4PBS溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖，其余条件一致。取不同时期的AGE-BSA2.0ml于650-60型荧光分光光度计上测其荧光值（激发波长390nm，发

7、射波长450nm，峰狭5nm），以2.0mlBSA按同样操作作为对照。1.2.2HRMC的培养加入DMEM培养液（含10mmol·L-1Hepes、0.37%NaHCO3、100U·L-1青霉素、100U·L-1链霉素及10%灭活小牛血清），置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中，隔日换液，每三天1:2传代一次。1.2.3HRMC的干预当细胞达到一定数量后将处于对数生长期的细胞按1:3移入6孔板中，待细胞长到次融合状态（细胞计数约为2×106）后换用无血清DMED培养24小时，然后分组干预：（1）分别用浓度为0、5

8、0、100、200、400、800mg·L-1的AGE-BSA干预细胞48小时，以DMEM组（0mg·L-1AGE-BSA组）作为空白对照；（2）选取敏感浓度400mg·L-1的BSA和AGE-BSA分别干预细胞0、6、12、24、48小时，以同时间BSA作为对照；（3）分别用浓度为0.1、1、10、100µmol·L-1的罗格列酮与AGE-B