aivha1和ctb融合蛋白在苏云金芽胞杆菌表面表达及其生物活性的分析

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1、AIV-HAI与CTB融合蛋白在苏云金芽胞杆菌表面的表达及其生物活性分析摘要禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)引起的禽流感疫病能给养禽业带来严重损失，同时还威胁着人类健康。疫苗免疫是控制禽流感的有效措施。传统疫苗需要注射免疫，操作复杂，且不能常温保存。利用S一层蛋白在芽孢杆菌表面展示病原体抗原的特性和芽胞的耐热性，可以开发出口服且具有热稳定性的疫苗。本研究室已利用S一层蛋白在苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)表面分别表达了多种禽类病原体抗原(刘梅等，2007；Liueta1．，2008a；Liueta1．，2008b)，其中，用表达禽流

2、感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)H5亚型血凝素HAl的重组菌株免疫雏鸡后，雏鸡产生了AIV-H5亚型的特异性抗体，但抗体效价(3．8(1092))与实际使用标准(4(10·92))尚存在一定差距。故本研究在刘梅等(2007)的研究基础上，利用霍乱毒素B亚单位(CholeratoxinBsubunit，CTB)能提高黏膜免疫的特性，将CTB和HAl融合表达在Bt菌株BMBl71表面，以期提高HAl免疫抗体效价，为研制耐热口服禽流感疫苗打下基础。1．血凝素基因hal和霍乱毒素基因ctb的克隆及重组质粒构建PCR扩增目的基因hal和ctb，同时在保证氨基酸序列不变的基础上对目

3、的基因的EcoRI和HincII限制性酶切位点进行点突变。通过重叠延伸PCR技术获得两种融合基因ctb．hal和ctb．1inker-hal。在表达载体pBMB982．304中S．层蛋白基因cfc的HincII／勋口I和艮oⅪ酶切位点处，分别插入目的基因和操纵子csaAB，得到重组质粒pCSCH(csa．ctc．ctb．hal)、pCSCLH(csa．ctc．ctb．1inker-hal)和对照质粒pCSCTB(csa．ctc．ctbl、pCSHAl(csa—ctc—ha，)。2．含融合基因的重组菌株的构建及HAl的表达情况用电脉冲法将重组质粒转入苏云金芽胞杆菌BMBl71中，得到重组菌株MI

4、CTB(含pCSCTB)、MIHAl(含pCSHAl)、MICH(含pCSCH)和MICLH(含pCSCLH)。用血凝和血凝抑制试验检测上述4种重组菌株血凝素HAl的表达情况。结果显示，MIHAl、MICH和MICLH均有血凝活性，标准阳性血清能够抑制重组菌株的血凝能力，表明HAl蛋白在BMBl71表面得到表达且具有活性。3．重组菌株的遗传稳定性重组菌株MICH和MICLH在无抗性LB培养基中连续培养50代，每间隔10华中农业大学2012届硕士学位论文代用Erm抗性LB平板检测质粒稳定性。结果显示，MICH培养50代后质粒稳定性为80％；MICLH培养30代后稳定性为86％，50代后质粒基本丧

5、失。4重组菌株对雏鸡的免疫原性MICH和MICLH培养至稳定期离心收集菌体，用lxl09CFU菌液口服免疫艾维因肉雏鸡3次，检测血清IgG．HAl和黏膜SIgA．HAl抗体水平，直接ELISA检测黏膜总IgA效价。ELISA和HI结果显示，免疫重组菌株MICH的雏鸡血清，一免后HAl特异性抗体水平上升，之后抗体水平逐渐下降；而免疫重组菌株MICLH免疫的雏鸡，其IgG抗体水平升高不显著。洗液SIgA．HAl检测结果显示，MICH气管黏膜IgA虽与对照组差异显著，但ELISA最高值也仅为O．113(OD450)。总IgA检测发现，MICH试验组能够诱导鼻腔、气管和肠道黏膜产生高水平的总IgA，但

6、只有鼻腔总IgA水平差异显著。动物实验结果表明，试验组体液免疫和局部抗体效价虽有升高，但升高幅度不显著，CTB的免疫佐剂作用未能发挥，难以实际应用。关键词：血凝素HAl；霍乱毒素B亚单位；苏云金芽胞杆菌；S．层蛋白；黏膜免疫；IIAJv-HAl与CTB融合蛋白在苏云金芽胞杆菌表面的表达及其生物活性分析AbstractAvianinfluenzaisahi曲lycontagious，actuerespiratorydieasesbyInfluenzavirusAinOrthomyxoviridae，whichcausedhugelossesofpoultryhusbandryandtheeate

7、nedthehumanshealth．Vaccinationisthepreferredstrategyforthepreventionandcontrolofinfluenzainfections．Thetraditionalvaccineswereusedtoimmunitybyinjection，thatwasawkwardtohandle，andthevaccinesshouldbekep