人脐血源性多巴胺能神经元移植治疗帕金森病的实验研究

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1、人脐血源性多巴胺能神经元移植治疗帕金森病的实验研究博士掌位论文专业：神经病学博士研究生：黄仕雄导师：邢诒刚教授中山大学附属第二医院神经科，广州，510120摘要帕金森病(Parkinson’sDisea∞，PD)是中老年人常见的锥体外系统疾病。其病因未明，可能与遗传、环境因素等多因素有关。有资料显示，多种机制参与PD的发病过程，这当中包括氧化应激、对神经毒的易感性、兴奋性氨基酸毒性作用、免疫因素及细胞凋亡等。目前临床上以左旋多巴替代治疗和苍白球、丘脑毁损术和深部脑刺激术等手术治疗为主，然而药物治疗和手术治疗因其副作用、

2、疗效不稳定及其它并发症等各种因素限制了临床上的进一步推广。研究显示，用可以合成儿茶酚胺的细胞或组织移植重建受损多巴胺能系统被认为是帕金森病治疗的一种根本方法。干细胞移植是以从生命的源头治疗许多危害人类健康的难以治疗的疾病的方法。但目前研究较多的神经干细胞(NeuralStemCe赋NSCs)和胚胎干细胞(Embryomcscemcelk，ESCs)来源有限且涉及诸多伦理问题，骨髓间充质干细胞(bollemarrow，de晰cdmcsenchymalstem∞lls，BM-MSCs)又有较高的病毒感染危险，且随着年龄增长

3、其细胞数量和增殖分化能力也显著下降，较难满足临床需求，这些因素都大大地限制了这些干细胞今后的临床应用。因此寻找新的细胞来源成为神经系统疾病治疗中的热点。研究表明，人脐血(humanumbi蚴cordblood，HuCB)干细胞含量丰富，占有核细胞的O．98％，是造血、内皮、间充质和神经等多种干细胞的丰富来源，且人脐血间充质干细胞(humanmbilical人脐血源性多巴胺能神经元移植治疗帕金森病的实验研究博士掌位论文cordb100d-d甜vedMSCs，HUCB．MSCs)、表面标志和BM．MSCs相似，同样具有体外

4、向脂肪、神经和成骨细胞分化的功能。此外HUCB．MSCs具有生命力强、来源丰富、使用方便等明显的优点，这充分说明，删cB．MSCs的纯化和扩增将会为组织工程和细胞治疗提供新的细胞来源，在神经系统疾病的治疗中拥有广泛的应用前景，其应用潜能不可忽视。Nl盯1，是近年来发现的细胞核受体超家族的转录因子，定位于2q22．23，已证实Nurrl基因的过表达对DA能神经元的发育、分化起主导作用。最近的研究进一步表明该基因的过度表达对于体外培养的中脑神经前体细胞最终向多巴胺能神经元的分化起了决定性的作用。其作用机制尚不明确，主要可能

5、是在中脑分泌的某些特异性的信号诱导下，激活细胞内相应的转录机制引起特异性的酪氨酸羟化酶(TH)的表达。本课题组目前已成功克隆出N硼’l基因，并将该基因转入C17．2神经干细胞系中，在多种因子的协同作用下，成功使得该神经干细胞向多巴胺能神经元(dopamin盯gicneurom，DNs)分化，脑内移植这种分化的DNs后，可明显有效地改善动物的行为，免疫荧光示踪可见移植后干细胞可同宿主神经元有效的整合。利用壬I【珊．MSCs源性的多巴胺能神经元重建脑内黑质纹状体系统是移植治疗帕金森病的目标之一．本研究的主要目的是诱导转基因

6、删CB-MSCs在相应的微环境的诱导下分化为多巴胺能神经元，观察其在黑质纹状体系统中替代乃至于重建中的作用，从而掌握从人脐血间充质干细胞分化为巴胺能神经元的主动权。目前尚未见此类研究。本课题内容分为三部分：1．人脐血间充质干细胞的分离培养和鉴定；2．Nurrl基因转染人脐血间充质干细胞诱导分化为多巴胺能神经元；3．Nllrrl基因修饰的卸JCB．MSCs源性多巴胺能神经元移植治疗帕金森病的作用。第1章人脐血间充质干细胞的分离培养和鉴定目的对删cB。MSCs进行分离、纯化、培养和鉴定，为后续研究提供基础。Ⅱ人脐血源性多巴

7、胺能神经元移植治疗帕金森病的实验研究博士掌位论文材料与方法1．人脐血单个核细胞(MononuclcarCells，MNCs)的分离、传代无菌条件下采集脐血、沉降、离心后分离MNCs，以1×107密度接种后以含L-DMEM的完全培养基贴壁培养，待细胞融合达80--90％，进行传代、扩增培养。2．MSCs增殖能力的鉴定取融合达90％的MSCs，消化、制备成细胞悬液后接种，并依次于培养第l天至第9天消化细胞并计数，绘制成生长曲线，检测增殖能力。3．MSCs表面标志的检测将MSCs制备成细胞悬液，加入FITC或PE标记的抗人C

8、D29、CD34、CD44、CD45、CDl05、CDl06和CDl66抗体，应用FACScan流式细胞仪分析样本中相应标记抗原的阳性表达率。结果1．HUCB．MSCs的分离培养由脐血成功分离MNCs，接种后细胞贴壁良好并形成集落，原代5—7天后贴壁、增殖潜伏期7—10天，2—3周为细胞的快速增殖期，3-4周左右即达完全融合，各期