hsl的表达和活性与豚鼠精子发生的相关性研究

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1、硕士学位论文HSL的表达和活性与豚鼠精子发生的相关性研究硕士研究生：李蓉指导教师：于永刚摘要一、研究背景与目的世界卫生组织(WHO)预测，男性不育症、癌症和心血管病症将成为2l世纪危害人类健康最最严重的三大疾病。最近50年间，全球人类的精子质量降低，生殖能力也大大下降。我国临床统计，育龄夫妇中约lO％一15％患有不育不孕症；台湾省每10对夫妇中约有一对不育；北京协和医院专家对1980-1990年间诊治的万余例男性不育患者的统计结果，发现就诊人数后5年竟是前5年的2-3倍。在南海市某地，1991．1995年的就诊人数正好比1981．1985年翻了一番。上述情况表明，男性不育症患

2、者正在全球范围内不断增多。而在男性不育症的原因当中，精子发生障碍是其中一个重要的影响因素。精子发生是一种依赖于分泌调节的发育过程，其特征是由未分化的双倍体干细胞转变成高度分化的单倍体精子。这一分化过程是在雄性生殖腺(睾丸)的曲细精管上皮细胞中进行的，并且依赖于支持细胞(Scrtoli)与生精细胞的紧密接触，在促黄体激素(corpusluteum．stimulatinghormone，LH)和促卵泡激素(folliclestimulatinghormone，FSH)的作用下Leydig细胞分泌睾丸激素一睾酮(testosterone，T)作用于Sertoli细胞，从而刺激基因转

3、录和生殖细胞分化。因此，T、FSH和LH在生精过程中是必需的，尤其T是精子发生过程中的至关重要的因素。FSH是启动精子发生的重要因子。FSH通过环磷腺苷(cyclicadenosinemonomphsopate，cAMP)和钙离子信号途径直接调节支持细胞或生精细胞。FSH的作用可能是改变支持细胞的结构及功能，产生有利于精子发生的条件，从而启动精子发生。LH作用于Leydig细胞，每一个Leydig细胞有6000个LH受体，LH与其受体的结合，Leydig细胞内的c．AMP水平明显提高，这表明中文摘要LH能刺激腺苷环化酶的活性，膜电位(membranepotential，MP)

4、水平升高激活蛋白激酶，促进Leydig内蛋白质磷酸化，激活胆固醇转变为孕烯醇酮进而增强T的合成。T是精子发生调节中最为重要因素，睾丸中类肌样细胞和支持细胞是它的靶细胞。T作用于类肌细胞使之产生支持细胞调节蛋白，最终以T和支持细胞调节蛋白，实现对支持细胞的双重调节。从分子水平看，糟子发生和成熟分化过程是一系列特定基因程序性表达的过程，其中表达许多睾丸特异性基因，包括cAMP应答元件调控因子、干细胞因子(stemcellfactor，SCF)、熟休克蛋白(heatshockprotein，HSP70)、肿瘤相关移植抗原(turnout-associatedtransplantat

5、ionantigen，TATA)结合蛋白，EDDY将之统称为‘钞文基因”。在精子的生成过程中，一系列的基因表达和调控最终使得生精细胞表现出体细胞所没有的形态特征和细胞行为以及特殊的功能。并且生精细胞的生长发育要求非常严格的特殊环境。目前国际上主要通过RNA干扰、免疫相关技术、构建特殊的细胞系、以及转基因或基因敲除小鼠的方法研究与精子发生相关基因，对其分子基础有了长足的认识。本文的研究是基于激素敏感性脂肪酶(hormone．sensitivelipase，HSL)能调节脂肪酸、胆固醇以及类固醇的代谢，胆固醇代谢生成孕烯醇酮从而生成睾酮这一机制。并且睾酮是促使精子发生中最重要的因

6、素的之一，且HSL在睾丸中的特异性表达，从而建立动物分组。从分子水平研究HSL在睾酮生成中的作用，以及HSL的表达及酶活性和精子发生及成熟的相关关系。二、材料与方法(一)材料戊巴比妥钠、O．9％氯化钠注射液、Tfizol试剂、达晖RT-PCR反应体系、西班牙琼脂糖、达安基因实验伴侣、异丙醇、湘仪离心机、Eppendof冷冻离心机、北京六一电泳仪、捷达801凝胶成像分析系统、ABl9700扩增仪、EDTA溶液、buffer液以及激素测定试剂盒和脂肪酸测定试剂盒等。(二)方法’l、将不同年龄阶段的豚鼠依据预实验结果分成三组，分别为：6d的幼鼠、16d青春期豚鼠以及70d的成年豚鼠

7、，每组6只：麻醉处死后收集豚鼠的睾丸及附睾组织以及腹腔静脉血液。硕士学位论文2、对左侧睾丸、附睾组织进行匀浆(分成三部分)，取一部分匀浆用半定量RT-PCR方法检测睾丸和附睾组织中HSL的mRNA表达量，第二部分在37"C下比色法对HSL酶活性进行测定，第三部分用甘油三酯和胆固醇酯试剂盒对睾丸匀浆中的胆固醇酯和甘油三酯进行测定。3、对抽取的血液进行离心，放免法测定腹腔静脉血清中睾酮、促黄体生成素、促卵泡激素水平。4、对右侧睾丸、附睾组织切片进行HE染色，并对睾丸和附睾组织切片进行组织形态学分析，观察有无