【8A文】2018第十八章-高效液相色谱.ppt

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1、1第十八章高效液相色谱（HPLC）2在已知化合物中能直接进行气相色谱分析的化合物约占15％，加上衍生化的化合物，也不过20％左右。高沸点、难挥发、热不稳定、离子型化合物、高聚物乃至生物大分子，很难用气相色谱法分析。在经典的液体柱色谱法基础上，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，引入气相色谱理论后发展起来的柱色谱技术称为高效液相色谱法。特点：应用范围广，分离效率高，分析速度快，灵敏度高，操作自动化等。3第一节高效液相色谱法的主要类型和原理固定相液液色谱、液固色谱分离机制基本类型：分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱其他：化学键合相色谱、离子抑制色谱、离子对色谱、亲合色谱、

2、手性色谱、胶束色谱、电色谱等。一、高效液相色谱法的主要类型4二、化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的色谱法（BPC）在HPLC中应用最广固定相：极性键合相-CN,-NH2,或二羟基等键合在硅胶表面应用：分离极性、中等极性的化合物（一）正相键合相色谱法5（二）反相键合相色谱法固定相：非极性键合相十八烷基硅烷（C18）、辛烷基（C8）等键合在硅胶表面流动相：水＋与水混溶的极性调整剂甲醇－水、乙腈－水6溶质的非极性部分在与极性溶剂分子间的排斥力的作用下，和键合相的烃基发生疏溶剂缔合；另一方面，溶质的极性部分受到极性流动相的作用，有解缔合作用。1.疏溶剂理论72.保留行为的主要影响因素（1

3、）溶质分子的结构溶质的极性越弱，疏水性越强，则与固定相作用越强，k越大，tR也越大。（2）流动相流动相表面张力越高，k越大流动相介电常数越大，k越大水的表面张力最大，有机溶剂含量增加，k值变小（3）固定相：键合烷基碳链越长，疏水性越强，k越大8（三）反相离子对色谱法在固定相上涂渍或流动相中加入与溶质分子电荷相反的离子对试剂，来分离离子型或可离子化的化合物的方法称为离子对色谱法反相离子对色谱固定相：C18或C8键合相流动相：含有离子对试剂的有机溶剂－水溶液应用适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型混合物的分离，还可借助离子对的生成引入紫外吸收或发荧光

4、的基团91.离子对模型102.影响容量因子的因素（1）离子对试剂的种类和浓度季铵盐，分析带负电荷的物质烷基磺酸盐或硫酸盐，分析带正电荷的物质试剂浓度：在浓度较低时，浓度升高，k增大试剂的烷基碳链越长，k越大（2）流动相的pH对弱酸、弱碱的保留有很大的影响11三、其他高效液相色谱法离子交换色谱用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以电导检测器为通用检测器分类抑制型（双柱型）、非抑制型（单柱型）应用无机和有机阴、阳离子，氨基酸，糖类，DNA和RNA的水解产物（一）离子色谱法12如样品为阳离子，用无机酸作为流动相，抑制柱为强碱性阴离子交换剂。在抑制柱中发生两个重要反应：R+－OH-+

5、H+Cl-→R+－Cl-+H2OR+－OH-+M+Cl-→M+－OH-+R+－Cl-式中，R+－OH-为抑制柱中的阴离子交换剂，M+为被测阳离子。抑制柱的作用：使流动相中的酸生成H2O，使流动相电导率大大降低；还使样品阳离子从原来的盐变成相应的碱，提高了组分电导检测的灵敏度。13（二）手性色谱法利用手性固定相或手性流动相添加剂分离分析手性化合物的对映异构体的色谱法分离原理对映异构体与手性选择物形成瞬间非对映立体异构“配合物”，因稳定性的不同而分离14（三）亲合色谱法利用或模拟生物分子之间的专一性亲合作用，从复杂生物试样中分离和分析特殊物质的一种色谱方法应用生物大分子的分离和分析在各种

6、色谱法中，选择性最高15第二节高效液相色谱法的固定相和流动相采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相为化学键合固定相非极性键合相C18ODS、C8、C1、苯基弱极性键合相醚基、二羟基极性键合相Si(CH2)3NH2、Si(CH2)2CN一、化学键合相色谱法的固定相（一）键合相的种类16（二）键合相的特点1.键合反应多为硅氧烷型键合相，以氯硅烷与硅胶反应而得2.含碳量和覆盖度含碳量：对键合硅胶进行元素分析得到表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例封尾：残余硅醇基的钝化处理17分离因子适当的溶剂k值适当的溶剂物理性质适当的溶剂全部溶剂二、化学键合相色

7、谱法的流动相18选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（流动相在使用前需用微孔滤膜过滤，除去固体颗粒，还要进行脱气）（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。19（一）流动相对分离