hbvcpg诱导抗乙型肝炎病毒免疫应答

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1、UniversityofScienceandTechnologyofChinaAdissertationfordoctor’SdegreeHBV-CpGInducesImmunityResponsesagainstHepatitisBVirusAuthor’SName：Speciality：Supervisor：Finishedtime：{ShujuanLvCellBiologyPro￡HaimingWeiDecember,2013中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本

2、人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：墨翅叠签字日期：．2口J牛3．岁中国科学技术大学学位论文授权使用声明作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或

3、扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。囱么开口保密(年)作者签名：圣塑叠导师签字摘要式细胞术检测野生型小鼠淋巴细胞的活化情况，放射性免疫法及ELISA法检测NP(HBV-CpG)联合乙肝疫苗接种野生型小鼠后的抗体应答；利用高压注射pAAV／HBVl．2质粒构建HBV携带小鼠模型，流式细胞术和ELISA法检测淋巴细胞的活化以及I型IFN的表达，放射性免疫法检测NP(HBV-CpG)联合乙肝疫苗治疗后HBsAg和HBsA

4、b的表达，荧光定量PCR技术检测联合治疗后HBVDNA的表达情况，免疫组化法检测联合治疗后肝脏HBcAg表达情况，H&E染色、转氨酶及胆红素检测观察肝脏损伤情况，流式细胞术内标IFN-y检测特异性CD8+T细胞的活化。通过上述研究方法，我们获得了以下研究结果：1。HBV．CpG诱导人pDCs细胞高表达IFN．a首先我们设计了一系列HBV基因组来源的CpG序列，将其分别刺激健康人PBMCs，ELISA检测上清IFN．Q的表达，由此筛选出高表达IFN．a的HBV-CpG，进一步流式细胞术验证HBV-

5、CpG是通过诱导Lineagel’，CDl23+，HLA-DR+的细胞即pDCs特异性表达IFN．0【，流式内标发现HBV-CpG刺激PBMCs后pDCs胞内TLR9表达上调，TLR7表达没有显著变化，内体酸化抑制剂氯喹处理后抑制了HBV-CpG诱导的IFN．0【的表达。以上结果证明了HBV-CpG诱导人pDCs表达IFN．a，依赖TLR9而非TLR7的途径。2．inhibitoryHBVoODN特异性抑制HBV-CpG诱导的IFN—a的表达在HBV基因组上我们同时发现了一些富集鸟苷的序列，EL

6、ISA法证明这些序列具有特异性抑制HBV-CpG诱导IFN．0【表达的能力，该抑制性序列命名为HBV-ODN。我们也发现这些抑制性HBV-ODN并不能抑制广谱CpG．2216诱导的IFN．a的表达，为了进一步证明HBV-ODN的抑制机制，我们应用免疫荧光技术发现HBV-ODN抑制了Gen2．2细胞对HBV-CpG的摄取及与TLR9的共定位。因此我们认为抑制性HBV-ODN特异性抑制了HBV-CpG诱导的IFN．0l的表达。3．NP(HBV-CpG)逆转HBV-ODN抑制IFN．伍的表达能力为了逆

7、转HBV-ODN的抑制效应，我们采用纳米材料PEG．PLA包被HBV-CpG，即形成NP(HBV-CpG)，当NP(HBV-CpG)与HBVoODN以2：1的比例刺激PBMCs时，IFN．Q的表达显著提高，而且NP(HBV-CpG)比HBV-CpG具有更强的活化pDCs、NK和T细胞的能力，进一步研究发现NP(HBV-CpG)同样可以诱导乙肝患者来源的PBMCs表达IFN．0L。根据以上结果我们证明HBV-CpG在纳米材料包被下可以逆转HBV-ODN抑制IFN—cc的能力并且可以诱导乙肝患者PB

8、MCs表达IFN．a。II摘要4．NP(HBV-CpG)活化野生型小鼠的淋巴细胞小鼠体内试验中，通过静脉注射NP(HBV-CpG)可以显著提高pDCs和cDCs表面CD40和CDS0的表达，以及上调NK和T细胞表面CD69和ICOS的表达。NP(HBV-CpG)体外刺激小鼠脾脏淋巴细胞，同样提高了pDCs和cDCs表面CD40和CD80以及NK和T细胞表面CD69的表达，而且pDCs和cDCs在NP(HBV-CpG)刺激下生存能力增强。以上结果证明NP(HBV-CpG)体内体外均具有活化小鼠淋巴