gab2对胶质瘤侵袭影响及机制研究

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1、Gab2对胶质瘤侵袭的影响与机制研究博士研究生：史立宏指导教师：罗荣城摘要胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，发病在所有颅内肿瘤约占40％，侵袭性高和预后差是胶质瘤的典型特征。高侵袭性会导致高复发率和高死亡率，因此迫切需要深入理解胶质瘤侵袭的分子机制，从而针对性地研究防治胶质瘤侵袭的药物和方法，改善患者的预后。Gab2是支架蛋白DOS／Gab家族的一个成员，这个家族还包含哺乳动物的Gabl--一Gab4蛋白。Gab2包含N端的PH结构域，中间富含脯氨酸的PRD基元及含多个磷酸化酪氨酸残基的C端。Gab蛋白绝大多数是间接通过Grb2介导聚集于活化的受体。在各种刺激下，Gab2发生酪氨酸磷

2、酸化产生数个锚定位点来介导与含有SH2结构域的蛋白如P13K的p85亚基结合。Gab2与P13K的p85亚基的结合在P13K．Akt．mTOR信号通路中起重要作用。近来，一系列的研究显示Gab2与肿瘤细胞的迁移和侵袭有关。首先，Gab2被检测到在乳腺癌细胞系与原发肿瘤中高表达。在Her2／Neu介导的沉默Gab2的小鼠模型中Gab2缺乏的细胞迁移能力降低，小鼠乳腺癌发生的肺转移也减少，提示Gab2能促进乳腺癌的转移。其次，有研究发现卵巢癌组织中Gab2高表达，而且Gab2通过活化P13K通路促进卵巢癌细胞的转移。另外Gab2也高表达于恶性黑色素瘤、胃癌、肺癌及急性髓性白血病。然而，到目前

3、为止，Gab2蛋白在胶质瘤中的表达及Gab2是否影响胶质瘤细胞的迁移和侵袭尚不明确。本研究首次检测了Gab2在胶质瘤中的表达，探讨了Gab2在胶质瘤侵袭中的作用，结果提示Gab2在胶质瘤侵袭中有重要作用，可以作为判断胶质瘤预后的有效分子指标。摘要方法1．组织标本163例福尔马林固定石蜡包埋的胶质瘤组织来源于1997年1月到2007年12月之间在潍坊医学院附属医院与潍坊市人民医院接受脑胶质瘤手术切除的患者，其中胶质瘤I级(pilocyticastrocytoma)23例(14．1％)，II级48例(29．5％)，III级52例(31．9％)，IV级40(24．5％)。所有标本经10％qh性

4、福尔马林液固定，常规脱水包埋，5um连续石蜡切片及HE染色，每例病理切片均经两位病理医师确诊。按国际抗癌联盟(uIcc)帝U定的胶质瘤分期标准对患者的详细临床资料进行分析。2．免疫组织化学按照SantaCruz公司所提供的操作步骤进行。切取5um厚的组织切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，柠檬酸缓冲液和微波加热进行抗原修复，过氧化氢孵育中和组织中的过氧化氢酶，滴加羊血清封闭，加一抗37℃孵育30min后置于40C冰箱过夜。第二天加亲合素结合的二抗，ABC溶液孵育，DAB染色，苏木精复染细胞核，脱水、透明、干燥后封闭液封片，光学显微镜下观察。3．IHS评分法评分结果判断由两名经验丰富的病理学教

5、授，对免疫组化切片结果判断评估。细胞质或者核内见淡黄色细颗粒显著高于背景颜色为阳性细胞。每张切片选取5个高倍视野观察结果。采用IHS评分法，分数可能范围O～12。IHS分值9～12为强阳性，5--．8为中度阳性，1～4为弱阳性，0为阴性。0--一4为低表达，5～12为—j一—．-、●局表达。4．免疫印迹实验组织／细胞蛋白提取：剪取适量组织并尽量剪碎，加入ⅪPA裂解液(含ImMDTT和蛋白酶抑制剂)，4"C搅动裂解20min。细胞蛋白的提取则向生长铺满瓶底的培养瓶中加入lmL预冷的RIPA裂解液，冰上晃动20min。取得的蛋白裂解液13000RPM离一L,10min，测定上清蛋白浓度。加适

6、量体积的上样缓冲液，煮沸变博士学位论文性。免疫印迹检测：蛋白溶液经SDS电泳、转膜，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭液封闭2h，13-actin作为内参照，加一抗后4"C过夜。TBST洗膜5minx3次后，加二抗并置于水平摇床摇动2h。按上述方法洗膜后力HECL并曝光。以目的蛋白条带的灰度值与内参照蛋白条带的灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。实验重复3次。5．细胞培养与转染三种胶质瘤细胞U87、LN229和U251均在含10％FBS的RPMI1640培养基中，37。C，5％C02培养箱培养。细胞达到60％．70％融合后按照Lipofectamine2000的产品使用说明书进行质粒转染操作。

7、将对照小RNA干扰质粒与Gab2特异性小RNA干扰质粒(干扰序列撑l：5’一GTGAGAACGATGAGAAATA一3’；≠}2：5’一GATGCAGGCCTGACCTTTA-30(购自Invitrogen公司)转染入细胞，通过RT．PCR、Western．blot验证干扰效率；使用含有终浓度为0．7ug／mLG418(新霉素)的培养基进行筛选。选择干扰效率高的稳定转染的单克隆细胞用于后续试验。6．RT-PCR用TransZolUp