试剂的配制方法

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1、试剂的配制方法：1.1.1.2高渗溶液0.01mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)，20mmol/LMgC12，0.5mol/L蔗糖。1.1.1.3醋酸一醋酸钠缓冲液(pH4.8)甲液:准确称取27.22gNaAc·3H2O(Mr=136.08)在200mL烧杯中，蒸馏水溶解并定容至IL配制成0.2mol/L的NaAc溶液。乙液:移液枪精确量取11.8mL冰乙酸(99.0%)，定容到1000mL，配制成0.2mol/L的NaAc一HAc溶液。待用时，量取410mL乙液与590mL甲液混合配制成pH=4.8的0.2mol/L的HAc一NaAc

2、缓冲溶液1000mL。1.1.1.4DNS试剂甲液:NaOH104g溶于1300mL蒸馏水中。乙液:3，5一二硝基水杨酸30g加入甲液中混匀，加热溶解。丙液:酒石酸钾钠910g溶于2500mL蒸馏水中。丁液:25g重蒸酚，加25g无水亚硫酸钠，加入丙液中。将以上各步骤的溶液混合，加入1200mL蒸馏水(总体积5000mL)，放在棕色瓶中，暗处放置一周后即可使用。1.1.1.51%CMC一Na溶液称取1.000gCMC一Na于100mL烧杯中，加入20一40mL、0.2mol/L、pH4.8的HAc一NaAc缓冲液，加热溶解，转移到100m

3、L容量瓶定容，4oC冰箱保存，保存期l一2周。1.1.1.61%水杨苷溶液称取l.000gD一水杨苷(D一saliein)于100mL烧杯中，加入适量的0.2mol/L、pH4.8的HAc一NaAc缓冲液，加热溶解，转移到100mL容量瓶定容，4。C冰箱保存，保存期l一2周。试验操作方法：l)葡萄糖标准曲线的绘制准确称取100.0mg分析纯的无水葡萄糖(预先在105℃干燥3一4h至衡重)，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL容量瓶中，再定容到刻度，摇匀，浓度为lmg/mL。取8根试管，从0一7编号，分别加入0、0.2、0.4、0.6、

4、0.8、1.0、1.2与1.5mLlmg/mL的葡萄糖溶液，共8个处理。每管加入DNS试剂2mL，置于沸水中，水浴10min，再冰浴冷却，以蒸馏水定容到10mL，混匀，于540nm测定OD值。以OD540一葡萄糖含量作图，得到葡萄糖的标准曲线，线性回归得到扩=0.9962>0.9950，线性效果较好(2)滤纸酶活(FPA)的测定滤纸酶活代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β一葡萄糖苷酶所组成的复合酶系的协同水解纤维素的能力，是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。滤纸酶活单位定义为:以滤纸为底

5、物，在一定条件下(pH4.8;50℃恒温lh)，以1mL纤维素酶液1min催化水解纤维素生成1umol的葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以IU表示。将lx6cm(50.000mg)(定量滤纸直径12.5cm)折叠放入试管底部，加入lmLpH4.8的HAc一NaAc缓冲液和0.5mL适当稀释倍数(粗酶液)的发酵酶液，混匀。置于50℃水浴60min，冰中冷却，加入2mLDNS试剂煮沸10min，冰中冷却，加蒸馏水定容到10mL，混匀，54Onm测OD值。对照处理:将0.5mL稀释酶液先于沸水中10min中灭活，加入1mLpH4.8的HAc一NaAc

6、缓冲液和滤纸条，再加入2mLDNS试剂煮沸l0min，冰中冷却，加蒸馏水定容到10mL，混匀，540nm测OD值，每个处理3个平行。根据标准曲线方程计算酶活性。(3)CMC梭甲基纤维素酶酶活测定(CMC酶活/内切葡聚酶活)酶活代表内切葡聚糖酶活。其单位定义为:以l%梭甲基纤维素钠为底物，在yi定条件下(pH4.8;50℃恒温15min)，以1mL纤维素酶液1min催化水解梭甲基纤维素钠生成1umol的葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以IU表示。取0.5mL适当稀释倍数的粗酶液，加入1mLI%CMC一Na溶液，混匀，置于50℃水浴15min，冰中

7、冷却，加入2mLDNS煮沸10min，冰中冷却，加蒸馏水定容到10mL，混匀，540nm测OD值。对照处理:0.5mL培养液加入1mLI%CMC一Na溶液，再加入2mLDNS煮沸10min，冰中冷却，加蒸馏水定容到10mL，混匀，540nm测OD值，每个处理3个平行。根据标准曲线方程计算酶活性。(4)p一葡萄糖昔酶酶活测定(纤维二糖酶)取0.5mL稀释适当倍数的发酵液，加入1mLI%水杨普溶液，混匀，置于50℃水浴30min，冰中冷却，加入2mLDNS煮沸10min，冰中冷却，加蒸馏水定容到10mL，混匀，540nm测OD值。对照处理:0

8、.5mL稀释酶液加入1mLI%水杨昔溶液，再加入2mLDNS煮沸10min，冰中冷却，加蒸馏水定容到10mL，混匀，于540nm测OD值。以1mL纤维素酶液1min催化水解水杨昔产生1umol