bmnpv da26基因及gp64融合表达抗肿瘤药物l天冬酰胺酶ⅱ

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1、BmNPVda26基因及gp64融合表达抗肿瘤药物L．天冬酰胺酶ⅡFusionexpressionofantitumordrugL-asparaginaseenzymeIIusingtheda26andgp64genesof专业名称姓2014年6月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的

2、法律结果由本人承担。学位论文作者签名：a药aol午6月IoH学位论文版权使用授权书IIIIIIIlUIIIIIIIIIIIIIIILIUIIIY2534107江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论

3、文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密√。学位论文作者签名：＆戴卫f午年6月扣日指导教师签名：≥乙受鸟加件年6月p日江苏大学硕士学位论文摘要杆状病毒是大型的双链DNA病毒，主要感染昆虫，该病毒作为重要的基因工程载体，在昆虫细胞或虫体中表达外源蛋白，通过极晚期基因的启动子polh或p10可使外源蛋白高水平表达。家蚕杆状病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，BmNPV)的da26基因产物(BV／ODV-E26)是一种包膜蛋白，可以包被于多角体的外膜表面。本研究利用da26基因融合表达外源基因，使外源表达产物结合于病毒颗

4、粒，通过超声裂解和差速离心法将外源蛋白分离纯化。L-天冬酰胺酶II(L-asparagineenzymeII，L-ASP)是一种酰胺基水解的酶类药物，在临床上广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病的治疗。目前，主要采用大肠杆菌生产的L．ASP产品。但由于可能污染内毒素等原因，存在一定的安全隐患。本实验尝试利用安全的杆状病毒表达系统表达L-ASP。通过基因重组技术，构建杆状病毒的转移质粒pFastdual-Pph-polh—Ppl0-da26-asp(全长)以及pFastdual-Pph-polh—Ppl0-da26-asp(s)(成熟肽)，获得表达L—ASP全长以及成熟肽的重组

5、家蚕杆状病毒，感染家蚕细胞后进行表达。GP64是杆状病毒核型多角体病毒组I的主要囊膜糖蛋白，它的结构可以在病毒粒子(Buddedvirus，BV)表面展示外源蛋白。本研究通过BmNPV的囊膜糖蛋白GP64的表面展示元件，在病毒粒子表面展示L．ASP成熟肽，探讨表面展示的BV作为抗肿瘤药物的可行性。构建表面展示的重组转移载体pFastBaedual-eplO-gp64sp-asp(s)-gp64ctd，转化含BmNPV基因组的大肠杆菌EcoliDHl0BaeTM，通过蓝白斑筛选发生重组的克隆，获得重组杆粒DNA。将重组杆粒DNA转染BmN细胞，获得重组病毒，感染BmN细胞，

6、收集感染的病毒液，进行BV的超速离心纯化。检测表达融合L．ASP的酶活性，并通过Westernblot验证融合蛋白的表达。与da26基因融合表达的L．ASP全长、成熟肽的酶活性分析结果表明，融合全长L．ASP的活性为2113．52U／mg，融合成熟肽的表达活性为2279．87U／mg，说明融合表达的L—ASP均具有活性。但细胞内多角体的数量较少，对总体产量和产品纯化有影响。与gp64基因融合表达的L-ASP在细胞中的活性为1788．4U／mg，Westernblot检测到纯化后的BV含L．ASP蛋白，但纯化的BV液中检测不出L．ASP酶活性，表明构建的杆状病毒GP64展示

7、系统可以将L．ASP转运到TBmNPVda26基因及gp64融合表达抗肿瘤药物L-天冬酰胺酶IIBV上，但在转移过程中可能由于蛋白结构发生变化，造成酶活性丢失，相关研究有待进一步深入。综上所述，L．ASP在杆状病毒中可以进行表达，但通过da26融合表达以纯化表达产物的设计及通过GP64表面展示的方式均存在着一定的不足，目前尚不能直接应用，有待改进。关键词：杆状病毒；da26；L-天冬酰胺酶Ⅱ；多角体；GP64表面展示II江苏大学硕士学位论文ABSTRACTBaculovirusesarelargedouble-stranded