“劳倦过度、房事不节”肾阳虚模型小鼠免疫功能和精子发生改变的研究

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1、。劳倦过度．房事不节”肾阳虚模型小鼠免疫功能和精子发生改变的研究实验研究一、材料与方法(一)实验材料I．实验动物：昆明种健康雄性小白鼠60只，体质量30-409；雌鼠240只，体质量25—309；由山东中医药大学实验动物中心提供。2．实验药品：戊酸雌二醇由法国Scherings．A公司生产，批号为037B-2。金匮肾气丸由山东济南市宏济堂制药有限责任公司生产，批号为20050412，主要成分：干地黄、山茱荑、山药、附子、泽泻、茯苓、丹皮、桂枝。3．实验试剂：IL一2试剂盒由北京美迪科生物技术有限公司提供，批号为20050617。Bcl一2试剂盒购自北京中山生物医学工程有限公

2、司，批号为20051107。睾酮放射免疫试剂盒，购于北京中山生物医学工程有限公司，批号为20051104。4．主要实验仪器6MF型全自动Y一放射免疫计数器，江苏省医疗电子研究所生产；DDL一5冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂生产；POLYVAR万能研究显微镜；电子天平(WTll001R)型，江苏省常州市万得天平仪器厂；石蜡切片机。(二)实验方法1．动情期雌鼠的准备及雄鼠的筛选(I)动情期雌鼠的准备：雌鼠每天灌胃戊酸雌二醇混悬液0．Iml／lOg(含药0．0013mg)，以阴道涂片检查角化细胞证实此鼠处于动情期嘲。(2)雄鼠的筛选：将每只雄鼠与两只动情期雌鼠共笼，次日取出雌鼠有

3、阴道拴笼中的雄鼠为实验用雄鼠。2．实验动物分组、造模及给药实验用雄鼠60只随机分为3组，每组20只。(1)对照组：常规饲养，每天灌胃蒸馏水0．Iml／lOg。(2)“劳倦过度、房事不节”肾阳虚模型组(简称模型组)：每天8：00在水深25cm、水温2522、容积5000ml的圆形玻璃缸内强迫小鼠游泳至无力而下沉时捞出，山东中医药大学2007届硕士擘位论文以造成劳倦过度。每只雄鼠与6只动情期蟾鼠同笼，每天更换动情期雌鼠以诱导房事不带，每天灌霉蒸馁水0。Iml／lOg，共实验4周。(3)金匮肾气丸治疗缀；造模方法同模型组，根据小鼠不同体质量每天灌胃举嚣含药量豹鑫匿‘霉曳丸混惹渡0

4、。Iml／lOg(会蘩0。02349)。共实验4周，第2、4周末每组随机处死lO只小鼠，即每批每组lO只，每批接鞠炎。金嚣鬻气丸混基滚醚潮方法：正常入耀量：一天2次，一次l兔(99／丸)，入与209小鼠比例为l：0．0026，小鼠每千克体熏用量为；99X2X0．0026×1000／20=2．349。3，指据检测及方法(1)胸腺指数、脾指数的测定：小鼠处死前电子天平称其体质量，处死后，娩瑟取荚建艨秘薅，叟理登拳净洗，吸去表瑟渡体，瞧予天平豫重。谤葵鼹藤器数和薅指数。瓣藤捂数：璃藤指数=瓣豫重／体重脾指数：脾指数=脾脏重／体重(2)IL一2的稔澜：小鼠称重稀，戊巴比妥麻醉，解割

5、，鹱主静脉取瓶，离心，取瓶清，按IL_2放免试剂盒说明书操作。(3)瓶清睾酮测定：下腔静脉取血，5％EDTA抗凝，4"C条件下，以3000转／分离心lO分锋，分离瞧涛。羧放射免疫分摄试裁盒骢要求溅定睾舔戆含量。(4)肇丸组织形态学观察采珥髓染色：三缝雄簸聪臻鲶死螽，辎离辇兔，霉予中毪福尔骂拣串羲定，敬材梯度酒精脱水，=甲苯透明，56-58℃浸蜡，包埋、常规切片，厚度为5urn，展片，干净玻片捞片，60℃烘烤l小时后，二甲苯脱蜡5-10分钟(×2次)，经无永乙醇l一3分钟(×2次)、95％7,醇I-3分钟(x2次)、80％乙醇1分钟(×2次)由赢到低梯度酒精水化后，蒸馏水水洗

6、，苏木綮精染液5—10分钟，蒸馏水水洗后，1％盐酸乙醇分化l一3秒，l％氨水洗返蘸，滚水诤洗居，0。5％伊绞潦色l峭分锋，蒸镩本承洗经凑80％乙醇卜2分钟(×2次)、95％乙醇2q分钟(×2次)、无水乙醇3—5分钟(×2次)赉低到蓬撵疫滔穗残承蓐，石炭酸与二译苯透鹱≯5分镑，孛经拷荻瓣背。(5)肇丸组织中Bcl一2蛋白的寝达采耀免疫组织纯学染色4“劳僖髓廑、辛事蒜节”雾辑虞模型小鼠免疫动能和糖子发生改变的磺霓①睾丸称麓后，立刻用4％多聚甲醮固定I小时。②玻冀溺多蒙羧氯羧楚理。常瓣魏零、浚蟥、纛蠼，辏背簿度6um。③常规脱蜡至水。30％H。Od份+蒸馏水10份混合，室温10分

7、钟，以灭活内源憔酶，蒸镑零洗3次。④切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶。37"C消化20分钟，PBS洗3次X5势锋，蒸馏永浚1次。⑤艋匿定：用1％多浆甲醛嶷温嬲定lO分钟，蒸馏水洗涤3次。⑥颥杂交：千的杂交盒底部加2096曾油20ml以保持湿度。按每张切片20ul加预杂交液，毽滠瓣4e℃，3，l、封，暖载多余渡体，零浚。杂交：褥张切片20ul凝交液，加在切片上，将原位杂交专用载玻片的保护膜搦好鬟，墓在镪麓士，毽澄籍38-42℃杂交蓬寝。杂交后洗涤：揭开盏玻片，37℃水温的2Xssc洗涤5分钟×2次，37℃水温的