化学交联aβ神经毒性及及胰岛素受体相互作用地研究

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1、大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：作者签名：大连理工大学硕士学位论文摘要淀粉样蛋白p(,知-ny’]oidp，Ap)是阿尔茨海默症的重要特征分子之一，同时也

2、被认为是该病的主要风险因子。AB单体能够进行自我聚集形成分子量各异的多种聚集体，并通过多种方式损伤神经系统，其中寡聚体AD与重要信号通路的受体相互作用被认为是其发挥神经毒性的核心方式。化学交联方法是A13研究中用于制备寡聚体A13的主要手段，但化学交联过程是否对Ap聚集体的性质和神经毒性产生影响尚未得到明确的阐释：。本论文以传统的非交联方法制备的AB寡聚体为对照，对非修饰蛋白的光催化交联法(photo．inducedCROSS．1inkingofunmodifiedproteins，PICUP)

3、和Cu2+氧化交联法制备的Ap聚集体的性质和神经毒性进行了研究；另外，已有研究报道不同的AD寡聚体具有不同的神经毒性，而对于不同的AB寡聚体是否通过不同的途径产生不同的病理作用还没有明确的报道，本论文以神经元胰岛素受体(insulinreceptor，IR)为研究对象，研究了PICUP法制备的不同的寡聚体对胰岛素受体分布的影响。研究结果如下1)，通过控制PICUP和Cu2+氧化交联的反应条件，获得了两种不同方法制备的一定分子量范围的A6聚集体，并通过透析方法除去了溶液中的交联剂。通过tricin

4、e．SDS．PAGE检测发现，不同制备方法获得的Ap中，Ap单体所占总体比例存在明显差异，不同分子量大小的Ap寡聚体所占比例略有不同，其中PICUP法制备Ap聚集体的效率最高，非交联法获得AB聚集体的量最低；Zeta电位检测发现，三种A13溶液的Zeta电位均处于．10～15mV区间，属于具有进一步聚集趋势的非稳定状态。硫磺素T检测表明，Cu2+氧化交联Ap具有远低于非交联Ap和PICUP．Ap的p．片层结构密度，显示其可能具有不同于其他两者的神经毒性。2)本论文使用上述3种AB对新生SD大鼠海

5、马神经元进行了浓度梯度处理，通过MTT检测、流式细胞术以及Western印迹法对神经元存活率、不同时期凋亡率以及关键凋亡蛋白的活化程度的检测，比较了不同方法制备的Ap的神经毒性。结果表明在三种Ap中，Cu2+氧化交联Ap降低神经元存活率的能力最强，能够最高程度地诱导神经元进入早期／中晚期凋亡，引起了凋亡蛋白Caspase3活化程度的显著上调，并且导致细胞浆中细胞色素C含量升高。然而，在Cu2+氧化交联AB引起Caspase9活化的过程中，可能存在对Caspase9上游信号的调控而最终体现为和另外

6、两种Ap相似的Caspase9活性。此外，三种Ap都具有引起T-NOS和CAT酶活上调的能力，其中Cu2+／I-1202交联Ap较强的CAT活力上调功能表明该交联AD具有更复杂的毒性机理。3)利用电洗脱回收和有机溶剂沉淀法，成功分离和富集了2-4聚体A13，分别使用不同寡聚态的AB进行了神经元处理，并观测了神经元IR受到的影响。细胞免疫荧光试化学交联AB的神经毒性及与胰岛素受体相互作用研究验结果表明：二聚体AB主要具有诱导IR重新分布的作用，而三聚体和四聚体更倾向于竞争性结合IR并引起IR密度降

7、低。关键词：淀粉样蛋白D；化学交联；神经毒性；胰岛素受体大连理工大学硕士学位论文TheResearchoftheNeurotoxicityandtheInteractionwithInsulinReceptorofChemicalCross·linkedAmyloid—pAbstractAmyloid·p(Ap)isahallmarkofAlzheimer‘Sdisease(AD)，andisconsideredasamajorriskfactorofAD．ADmonomerformsaggre

8、gatesofdiversemolecularweightbyself-assembly．TheA13aggregatesimpairnervoussystemindifferentways，inwhichtheinteractionsbetweenoligomericADandthereceptorsofimportantsignalingpathwaysweredemonstratedasacentralmechanismofApneurotoxicity．InApstudies，chemi