人牙龈成纤维细胞诱导分化为骨骼肌样细胞的探讨

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1、英文摘要Keywords：Humangingiva；fibroblasts；skeletalmusclecells；cellculture；differentiation5研究论文人牙龈成纤维细胞诱导分化为骨骼肌样细胞的探讨前言口腔的基本生理功能如咀嚼、发音和面部表情运动都需要骨骼肌的收缩来实现。发育成熟的骨骼肌细胞为终末分化细胞，自身再生能力很弱。虽然肌卫星细胞在肌肉受到损伤时可以激活并参与受损组织的修复，但数量很少，不能满足组织修复的需要。骨骼肌组织损伤后，通常为肉芽组织修复，形成瘢痕，从而严重影响运动功能。因此寻

2、找到容易获得的能够向骨骼肌细胞分化的细胞成为急需解决的问题。问充质千细胞来源于中胚层，具有多向分化能力，存在于不同种属，包括人在内的动物体内的结缔组织中【7】。骨髓间充质干细胞能在体外培养条件下由不同的刺激信号分别诱导分化成骨骼肌细胞、心肌细胞和神经细胞等[sJ。人体牙龈组织存在充足的成纤维细胞，同时也存在间充质干细胞，具有在不同的诱导条件下向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞和脂肪细胞等分化的能力t9d¨，其多向分化的潜能为心血管疾病、神经系统疾病和骨关节疾患的治疗提供了一条全新的探索空间。如果成纤维细胞的多项分化潜能被

3、证实，人们对肌肉缺损、肌肉疾患的治疗看到了新的希望。由于成纤维细胞在体内分布广泛、数量巨大、部位表浅、取材方便、培养传代易行、分裂增殖迅速，其逐渐成为了研究的热点。该课题也是围绕着成纤维细胞能够分化为上皮细胞的基础上，也就尝试着让其分化为骨骼肌细胞。本研究选择牙龈成纤维细胞，通过加入特定的诱导条件，促使其向骨骼肌细胞的方向进行分化，通过倒置荧光显微和SEM下形态学观察、免疫细胞化学、Masson特殊染色鉴定，探讨牙龈成纤维细胞向骨骼肌细胞分化的潜能和可能性，从而为临床上骨骼肌再生修复提供新的方法。研究论文材料与方法一、

4、标本：下颌阻生齿拔出后切除的牙龈组织(河北医科大学口腔医院口腔颌面外科)二、试剂与主要仪器(一)试剂：PV9000免疫组化试剂盒：包括其中试剂一，试N-，去离子水。北京中杉金桥生物技术有限公司DAB显色试剂盒博海生物工程公司Vimentin抗体北京中杉金桥生物技术有限公司Myosin抗体北京中杉金桥生物技术有限公司叶sarcometricactin抗体北京中杉金桥生物技术有限公司DMEM培养液Sigma公司，美国F12培养液Sigma公司，美国胎牛血清杭州四季青公司胰蛋白酶河北博海生物有限公司5一氮杂胞苷(5一aza)

5、Sigma公司，美国成肌分化因子(myod)Sigma公司，美国IGF—lSigma公司，美国青霉素华北制药厂链霉素华北制药厂二甲基亚砜(DMSO)美国Sigma公司亮绿中国Solarbio公司酸性品红国药集团化学试剂有限公司磷钼酸天津市大茂化学试剂厂橙黄G生物染色剂国药集团化学试剂有限公司丽春红S天津市光复精细化工研究所PBS磷酸盐缓冲液河北博海生物有限公司(二)主要实验仪器：AX．80多功能显微镜日本Olympus公司PM．10A荧光倒置显微镜日本Olympus公司研究论文光学显微镜(BX40型)SZ一93自动双重

6、纯水蒸馏器细胞培养瓶培养板202型电热恒温鼓风干燥箱5417R低温离心机超净工作台二氧化碳培养箱系列移液器三、实验方法：日本Olympus公司上海徐新生化仪器厂美国CoringCostar公司山东潍坊医疗器械厂德国EPPENDORF公司青岛康净净化消毒设备有限公司德国Heraeus公司德国EPPENDORF公司3．1人牙龈成纤维细胞的原代培养、传代培养及来源鉴定3．1．1人牙龈成纤维细胞的原代培养收集临床上阻生牙冠周龈瓣切除术后的正常牙龈组织，采用原代组织块培养法，去除坏死的组织和残留血管，剪成约1InlTl．3数小块

7、，均匀铺在25ml培养瓶上。加培养液少许，保持组织块湿润。培养液选用含20％胎牛血清的低糖DMEM(100U／ml青霉素和100U／ml链霉素，PH值为7．2)，倒置于培养箱37。C，5％C02及湿度95％条件4-6h，待组织块贴壁牢固后将培养瓶翻转，使培养液缓慢流过组织块直至将其浸没，置培养箱中继续培养，每3天换液，于倒置显微镜下严密观察细胞的生长情况。培养至第8天，组织块周围长出细胞晕，细胞呈梭形密集排列，少数细胞呈分散生长。以后每2天换一次液。到第11天，摘除组织块继续培养。3．1．2人牙龈成纤维细胞的传代培养当

8、细胞融合至70％时，进行传代培养。将旧培养液吸出培养瓶，用PBS液冲洗2遍，后加入约1ml0．25％胰酶快速冲洗培养瓶后立即倒掉。再加入约0．25％胰酶3m1，置于37。C，5％C02的恒温培养箱中3min，倒置显微镜下观察消化程度，随后加入20％血清的DMEM中和胰酶。吹打瓶壁上的细胞，使细胞脱离瓶壁后制成单细胞悬液，将细胞悬液