骨碎补对人牙龈成纤维细胞体外诱导作用的实验研究

《骨碎补对人牙龈成纤维细胞体外诱导作用的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中文摘要骨碎补对人牙龈成纤维细胞体外诱导作用的实验研究摘要目的：牙周病是危害人类健康的两大13腔疾病之一，主要由感染、创伤、遗传等多种致病因素引起，这些致病因素破坏牙齿的支持结构，最终导致牙齿松动、脱落，因此牙周病是成人失牙的主要原因。牙周病治疗是以修复牙周组织缺损、恢复牙周组织正常结构和功能为最终目标，目前常规的治疗方法却难以达到理想的组织再生效果。牙周组织再生的基础是牙槽骨和牙骨质的再生，存在的难题是病损局部能够参与骨组织再生的细胞来源有限，数量不足。继引导组织再生术后，组织工程技术的出现为实现

2、牙周组织完全再生提供了新的思路，成为研究热点之一。组织工程学的基本方法是将体外培养的正常组织细胞扩增后吸附于生物相容性良好，并可被人体逐步降解吸收的生物材料上，形成细胞一生物材料复合物，将这一复合物植入机体组织、器官缺损部位，种植的细胞在生物支架材料逐步降解吸收的过程中，继续增殖并形成新的具有原有特殊形态和功能的组织器官，达到修复组织器官的缺损和重建其功能的目的。组织工程技术的关键是获得大量功能相关的种子细胞。已有学者尝试引入骨组织工程技术治疗牙周组织缺损，并在动物实验中取得了初步的成效Ⅲ。但既往常

3、采集骨、骨膜、骨髓来源的种子细胞大都存在取材不易，对机体损伤较大的缺点。有实验证明乜1，某些来源于骨外组织的细胞，如成纤维细胞等，在诱导因子中文摘要的持续作用下，可以向成骨细胞转化并保持其成骨能力。但成纤维细胞的成骨能力是有条件的，即必须在特定条件影响下才能表现出其成骨特征。摸索促使成纤维细胞向成骨细胞转化并保持其成骨能力的适宜条件，须体外进行活细胞实验。在牙周组织中最主要的两种成纤维细胞是牙龈及牙周膜成纤维细胞。有研究表明，人牙周膜细胞具备多向分化潜能，因其在适宜诱导条件下能表达成骨细胞表型并能在

4、体外培养中形成矿化组织∞1而成为牙周组织再生中较为理想的种子细胞，但其来源有限，取材不易，且较难繁育。而牙龈成纤维细胞作为牙周组织的组成成分，来源丰富、容易获得、具有很强的生长和自我繁殖能力，虽较牙周膜细胞表达成骨表型及矿化的能力较弱，但可以设想，只要能对牙龈成纤维细胞施以有效的诱导因素，使其表达成骨细胞表型，则有望用牙龈成纤维细胞替代牙周膜细胞，成为牙周组织修复再生中理想的种子细胞。骨碎补为传统的中国骨伤科常用中药，具有补肾、活血、止痛、续骨疗伤之功效，其可促进体外成骨细胞增殖、分化、钙化。本实验

5、拟利用骨碎补独特的药理作用，将其作为一种诱导因子作用于体外培养的人牙龈成纤维细胞，通过观察对比所培养细胞的超微结构、碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)活性及细胞周期的改变，探索骨碎补对人牙龈成纤维细胞成骨表型的体外诱导作用等生物学特性的影响，骨碎补的药物浓度效应及最佳作用浓度等问题，为将来骨碎补诱导牙龈成纤维细胞表达成骨表型、代替牙周膜细胞应用于组织工程促进牙周组织再生提供一定的理论依中文摘要据，为其作为一种新型的诱导因子应用于人牙周组织工程领域提供新思路。方法；采用组织块

6、法分离培养人牙龈成纤维细胞，制备骨碎补提取液作用于细胞，通过观察细胞超微结构、ALP活性、细胞周期的改变，探讨骨碎补对细胞的体外诱导作用。1人牙龈成纤维细胞的原代培养、传代及来源鉴定选取需进行正畸减数拔牙的青少年健康牙龈，采用组织块法进行牙龈成纤维细胞的原代培养。当细胞生长至铺满瓶底80％时进行传代。经传代后获得大量可供实验用的种子细胞。取第2代细胞进行角蛋白染色及波形丝蛋白染色，做来源鉴定。2骨碎补提取液的制备将骨碎补加适量水煎煮，过滤，浓缩，醇沉，活性炭脱色，过滤除菌。所得提取液用含2％胎牛血清

7、(Fetalbovineserum，FBS)的DMEM(dulbecco’smodifiedeaglemedium)培养液稀释成5个不同的终浓度。调整PH至7．0～7．1，分装，4"C保存备用。3实验分组实验组细胞加入骨碎补提取液，对照组加入含2％FBS的DMEM培养液。4ALP活性测定取第4代人牙龈成纤维细胞，接种于24孔培养板中，随机分为5个浓度实验组和1个对照组，每组4孔。培养7d，弃孔内液体，加入TritonX一100，4℃过夜后，取上述各孔液体及空白对照的双蒸水一并转入另一96孔板。按AL

8、P中文摘要试剂盒说明依次按比例加入缓冲液、基质液，水浴，加入显色剂后在酶联仪上于410nm波长下测0D值，取每组4孔的平均值，间接反映细胞的ALP活性，以活性最高组骨碎补的浓度为最佳浓度用于以下实验。5形态学观察5．1在倒置相差显微镜下观察细胞游出及生长状况，并行吉姆萨染色，光学显微镜下观察。5．2扫描电镜观察取第5代生长状态良好的人牙龈成纤维细胞，接种于预先放有盖玻片的6孔板中。随机分为实验组和对照组，实验组用最佳浓度骨碎补提取液的培养基。培养7d，取出盖玻片，洗涤