ang与其突变体与ri相互作用对膀胱癌血管生成的影响与分子机制研究

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1、重庆医科大学硕士研究生学位论文formationoftumorbloodvessels.ByDualluciferasereportgeneassay,overexpressionofRInegativelyregulatesANGnuclearactivityinenhancingrRNAtranscription.5.InBALB/cmodels,ANGandmutantscouldpromotetumorangiogenesisandthegrowthofsolidtumor.Conclusionrib

2、onucleaseinhibitor(RI)andangiopoietin(ANG)anditsmutantsexistedinteractioninvitroandinvivo.ANGanditsmutantcanpromotetumorangiogenesis.over-expressionofRInegativelyregulatesANGnuclearactivityinenhancingrRNAtranscription.Finally,theinteractionbetweenRIandANGan

3、ditsmutantproteincanregulatethebladdercancerBIU87cellsandinfluencethegrowthandtumorvascularproliferationbyPI3K/AKT/mTORsignalpathwayinbladdercancer.Keywords:Ribonucleaseinhibitor,angiogenin,angiogensis,interaction,mutant7万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文ANG及其突变体与RI相互作用对膀

4、胱癌血管生成的影响及分子机制研究前言膀胱癌是泌尿生殖系统肿瘤最常见的类型之一，在男性最常见癌症中排名第[1]七种型和女性世界中第十七种最常见类型的癌症。在欧洲，2012年男性膀胱癌标准化发病率为26.9/100000，女性标准化发病率为5.3/100000。此外，人口年龄[2]标准化死亡率男性为8.5/100000和女性为1.8/100000。目前约75%患者是非肌肉浸润性癌，局限于膀胱粘膜（Ta期，原位癌，根据2009TNM分期膀胱癌）或粘[3]膜下层（T1期），其余25%膀胱癌是发生肌层浸润的患者。随着医

5、疗技术的提升尽管现在拥有许多的治疗，包括免疫治疗，化疗和手术治疗，但膀胱癌仍具有[4]高复发和高进展率。因此，治疗膀胱癌的新方法是迫切需要的。新治疗方法的临床前评价和探索需要建立一个可以刺激肿瘤动物模型。各种各样的动物膀胱癌模[5]型被建立，但肿瘤治疗采取率为30-100%建立动物模型的方法是可靠的，简单的，可行的和可重复的，但仍然是一个长久的挑战。核糖核酸酶抑制因子（ribonucleaseinhibitor,RI）是具有多种功能的酸性蛋白，能与血管生长因子紧密结合，对细胞内的RNA水平有一定的影响,对血管

6、[6]生长有强烈抑制作用。血管生成素（angiogenin,ANG）是研究较多的血管生成因子，它具有双重效应即肿瘤血管新生和细胞增殖,还具有核转位现象并且能促进核糖体RNA（rRNA）的转录。但是，RI与ANG的相互作用机制少有报道,RI是否可能直接与体内ANG某一部位结合，从而阻断了肿瘤血管生成和细胞增殖的信号通路和核转位进程，进而抑制肿瘤的生长和转移也是未知的。有研究者发现在多人种肌萎缩性侧索硬化症（amyotrophiclateralizingsclerosis，ALS）患者中ANG基因发生自然突变，提

7、示ANG突变而导致的成熟蛋白质功能丧失可能与ALS发病[7-8]密切相关。因此，我们针对ANG的活性位点（Activesite）第37位和第138位，即编码蛋白质的第13位和第114位（前24位为信号肽）进行突变，利用蛋白相互作用研究方法初步确定两者是否存在相互作用。将pEGFP-C1-ANGH13R、pEGFP-C1-ANGH114R、pEGFP-C1-ANG(本课题组构建保存)转染BIU87细胞，检测8万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文RI与ANG相互作用对BIU87细胞的影响及介导PI3K/AKT/

8、mTOR信号通路蛋白的影响。运用鸡胚绒毛尿囊（CAM）血管形成实验和小管形成实验检测ANG及其突变体对血管形成的影响。应用双荧光素酶报告基因检测过表达RI对ANG及其突变体促rRNA转录活性的影响。最后通过BALB/c模型我们发现ANG及其突变体可以促进肿瘤的生长，与对照组相比，实验组的新生血管明显增加，为进一步研究RI与ANG的相互作用机制打下基础。9万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文第一部分