牦牛外周血单个核细胞（pbmc）抑制性消减cdna文库构建以及重要功能分子克隆的分析论文

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1、甘肃农业大学硕士学位论文摘要外周血免疫相关细胞及其分泌的功能分子，在免疫调节、抗微生物、抗肿瘤以及细胞信号传导等方面发挥重要作用。脂多糖(LPS)和刀豆素A(ConA)作为丝裂原能激活淋巴细胞和单核细胞分泌一些细胞因子，这些因子的分泌受一个复杂的信号网络调节，该网络是由许多分子组成和参与。为筛选和发现一些新的免疫相关候选分子，研究其结构和功能以及参与免疫调节的作用机制，本研究应用抑制性消减杂交技术构建了经ConA和LPS联合刺激诱导的差异表达cDNA文库，并筛选、克隆和鉴定分析了重要功能基因。本研究以牦牛外周血单个核细胞为材料，以诱导刺激细胞的RNA合成的eDNA

2、为试验组，以未经诱导刺激的eDNA为对照组，经消减杂交和抑制性PCR扩增，将其产物与pGEM．TEasy载体连接，转化大肠杆菌JMl09，构建了牦牛外周血单个核细胞消减cDNA文库。从文库中挑选阳性克隆进行PCR鉴定，其插入片段在200-1000bp之间。随机选择非重复的6个有效EST序列，以半定量PCR方法验证其消减效率，结果显示均从消减文库中扩增到目的片段，其中5个为诱导性差异表达分子，1个为诱导特异性表达分子，说明该文库有较高的质量。文库中有效EST序列的测序和生物信息学分析表明，初步获得27条差异表达基因片段，其中3个克隆为未知功能的新基因片段序列，其余的

3、克隆涉及蛋白质合成、翻译和表达调控、信号转导和细胞间通信、细胞凋亡、细胞和机体防御、物质转运和代谢等功能分子，这些分子的克隆和发现对动物宿主分子免疫学创新性研究奠定了基础。本研究选择文库中与趋化因子受体4(CXCR4)和胸腺素0t原(ProTQ)高度同源的两个分子片段为研究对象。根据牛趋化因子受体4(CXCR4)和胸腺素Q原(Pr0Ta)全长基因设计引物，扩增、克隆和鉴定趋化因子受体4(CXCR4)和胸腺素a原(ProTa)这两个与免疫和信号传导相关的差异表达重要功能分子。DNA测序及其序列分析表明，克隆的CXCR4基因的开放阅读框为1062bp，编码353氨基酸

4、残基的前体蛋白，与登录的CXCR4基因cDNA序列同源性为99．6％；克隆的ProTa基因的开放阅读框为333bp，编码110个氨基酸残基的前体蛋白，与登录的ProTct基因cDNA序列同源性为98．2％。证明己成功克隆到CXCR4和ProTa全长基因。这两种重要功能分子全长基因的克隆和鉴定，对进一步研究其结构和功能以及阐述其免疫和信号传导的分子机制具有重要意义。关键词：外周血单个核细胞；诱导刺激：抑制消减杂交；cDNA文库；甘肃农业大学硕士学位论文Summary暑I————————————————————————————————一——Ill——鼍i皇曼!!詈詈!

5、SummaryFunctionalmoleculesofperipheralbloodimmune—relatedcellsplayallimportantroleinimmuneregulation，antimicrobial，antitumorandsignalling，et．a1．PeripheralBloodMononuclearCells(PBMC)werestimulatedbyconcanavalinA(ConA)andlipopolysaccharide(LPS)asmitogeninordertosecreteanumberofcytokines

6、．Thesecytokinesareregulatedbyacomplexsignalingnetwork，whichiscomposedofmanymolecules．Inthisstudy,wehaveundertakensuppressionsubtractivehybridization(SSH)andconstructeddifferentiallyexpressedeDNAlibraryofPeripheralBloodMononuclearCells(PBMC)toscreenandclonedifferentiallyexpressedgenesi

7、nresposetoLPSandConAinBosgrunniens．Theidentifieddifferentiallyexpressedgeneswillgiveinsightintoimmulleregulatorymechanismsinbosgrmmiens．Inthepresentexperiment，weusedPeripheralBloodMononuclearCells(PBMC)ofbosgrunniensasexperimentmaterial：eDNAfromthetreatedwithLPSandConA(astester)washyb

8、ridiz