传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cdna文库的构建论文

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1、传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建论文张萍，山丽梅，肖小河，付强【关键词】内皮,血管/细胞学；抑制消减杂交；动脉硬化【Abstract】AIM:ToconstructasubtractedcDNAlibraryofdifferentiallyexpressedgenesinfreshlyisolatedadultbovineaorticendothelialcells(FiBEC)andculturedneentsofnonexpressedorloentsplifiedlibrarylypickedan

2、didentifiedusingrestrictionenzymedigestion.RESULTS:Theamplifiedlibrarycontainedmorethan760bacterialclones.The64clonespickedrandomlyshoedigestion.CONCLUSION:Thelibrarylaysafoundationforscreeningandcloningthearteriosclerosisrelatedgenesinearlystage.【Key;vascular/cyto

3、logy;suppressionsubtractivehybridization;arteriosclerosis【摘要】目的：构建传代培养前后牛主动脉内皮细胞差异表达基因的消减cDNA文库，筛选动脉粥样硬化相关新基因构建文库.方法：采用抑制消减杂交技术，以新鲜分离和传代培养的牛主动脉内皮细胞作为对比材料，分离传代培养主动脉内皮细胞中不表达或低表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T/A连接构建文库.freelRNA提取试剂盒（美国Promega公司）；总RNA提取Trizol试剂,DMEM培养基干粉,胎牛血清,Super

4、ScriptTMRNaseH活性缺失反转录酶（美国GibcoBRL公司）；抑制削减杂交试剂盒（美国Clontech公司）；质粒提取试剂盒,PCR产物胶回收试剂盒（上海华舜公司）；IPTG,Xgal,TaqDNA聚合酶（上海生工公司）；保真LATaq酶,DL2000核酸分子质量标准（大连TaKaRa公司）.1.2方法1.2.1牛主动脉内皮细胞总RNA及mRNA分离提取参照Trizol试剂说明进行RNA提取；参照Z5300磁珠分离mRNA试剂盒操作说明进行mRNA分离提取.1.2.2抑制消减杂交参照文献［4］及SSH试剂盒说明以

5、FiBECcDNA为检测子（Tester），以CnBECcDNA为驱赶子（Driver）.①双连cDNA的合成：取Tester和DrivermRNA各2μg（4μL）分别与1μLcDNA合成引物混合，在3.3×108nkat/LAMV反转录酶1μL作用下合成第一链cDNA.立即在第一链合成反应液中加入20×第二链酶混合物、dNTP等，16℃反应30min，合成双链cDNA.抽提并沉淀cDNA，将沉淀物溶于50μL灭菌水中.②双链cDNA的酶切：取Tester和Driver双链cDNA各43.5μL，分别用RsaⅠ1.5μL于

6、37℃酶切1.5h.将未经酶切的dscDNA2.5μL与经酶切的dscDNA5μL用10g/L琼脂糖明胶电泳进行酶切效率的分析.酶切完全后，将酶切产物进行沉淀，沉淀物溶于5.5μL灭菌水中.③Tester双链cDNA与接头的连接：将酶切后的TestercDNA按1∶6稀释，各取2μL在T4DNA连接酶作用下，分别与接头1和接头2于16℃连结过夜.取1μL连接产物用200μL灭菌水稀释，进行连接效率分析.接头序列的adapter1(5′CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT3′

7、；3′GGCCCGTCCA5′)及adapter2(5′CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT3′；3′GCCGGCTCCA5′).④两轮消减杂交：检测接头连接效率满意（25%）后，将连接有不同接头的TesterdscDNA，于68℃杂交过夜.加入200μL稀释缓冲液.⑤两轮抑制PCR：取1μL消减杂交产物用两个接头的外侧序列引物（5′CTAATACGACTCACTATAGGGC3′）进行首轮PCR扩增.将PCR产物按1∶10稀释，取1μL用两个接头的内侧序列引物（5′TCGAG

8、CGGCCGCCCGGGCAGGT3′）及（5′AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT3′）进行第二次PCR扩增.产物用20g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析.1.2.3消减cDNA文库的构建参照文献［5］，用PCR产物纯化试剂盒纯化第二次PCR产物，按1∶1的浓度比混合纯化后的PCR产物及p