传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cdna文库的构建

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1、传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建:张萍，山丽梅，肖小河，付强【关键词】内皮，血管/细胞学；抑制消减杂交；动脉硬化【Abstract】AIM:ToconstructasubtractedcDNAlibraryofdifferentiallyexpressedgenesinfreshlyisolatedadultbovineaorticendothelialcells(FiBEC)andculturedneentsofnonexpressedorloentsplifiedlibraryl

2、ypickedandidentifiedusingrestrictionenzymedigestion.RESULTS:Theamplifiedlibrarycontainedmorethan760bacterialclones.The64clonespickedrandomlyshoedigestion.CONCLUSION:Thelibrarylaysafoundationforscreeningandcloningthearteriosclerosisrelatedgenesinearlystage

3、.【Key;vascular/cytology;suppressionsubtractivehybridization;arteriosclerosis【摘要】目的：构建传代培养前后牛主动脉内皮细胞差异表达基因的消减cDNA文库，筛选动脉粥样硬化相关新基因构建文库.方法：采用抑制消减杂交技术，以新鲜分离和传代培养的牛主动脉内皮细胞作为对比材料，分离传代培养主动脉内皮细胞中不表达或低表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T/A连接构建文库，将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后，随机挑取64个白色克隆进行酶

4、切鉴定.结果：扩增消减cDNA文库获得760个克隆，随机挑取的64个阳性克隆经酶切后均有200〜600bp的插入片段.结论：构建的传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库，为进一步筛选早期发生改变的动脉粥样硬化相关基因奠定了工作基础.【关键词】内皮，血管/细胞学；抑制消减杂交；动脉硬化0引言动脉粥样硬化是一种多因素损伤性疾病，许多基因在病变过程中均发生了改变，对发生变化的基因的深入认识将为探寻动脉粥样硬化的发病机理及病变特征提供坚实的理论基础.国内外报道的动脉粥样硬化相关基因多是oxLDL损伤前后

5、培养的脐静脉内皮细胞差异表达的基因，所报道的许多基因的变化是与动脉粥样硬化病变中发生改变的因子相吻和的［1］.但尚不具备病变组织特异性和病理损伤特异性.在血管内皮细胞培养后和动脉粥样硬化病变早期都发生G蛋白偶联受体功能的明显减弱或丧失［2-3］，从这一点上讲血管内皮细胞离体培养过程模拟了动脉粥样硬化病变早期血管内皮细胞发生的病理改变.本研宄采用SSHR技术，构建新鲜分离的成牛主动脉内皮细胞和传代培养的新生牛主动脉内皮细胞差异表达基因的消减cDNA文库，为进一步筛选早期发生改变的动脉粥样硬化相关基因奠定工作

6、基础.1材料和方法1.1材料成牛主动脉（购自北京市大红门淸真食品厂）培养分离后获得新鲜内皮细胞；传代（10代）培养的新生牛主动脉内皮细胞（美国CnBEC公司）；大肠杆菌菌株TG1本室保存；载体pGEMT，磁珠分离mRNA提取试剂盒（美国Promega公司）；总RNA提取Trizol试剂，DMEM培养基干粉，胎牛血清，SuperScriptTMRNaseH活性缺失反转录酶（美国GibcoBRL公司）；抑制削减杂交试剂盒（美国Clontech公司）；质粒提取试剂盒，PCR产物胶回收试剂盒（上海华舜公司）；IP

7、TG，Xgal,TaqDNA聚合酶（上海生工公司）；保真LATaq酶，DL2000核酸分子质量标准（大连TaKaRa公司）.1.2方法1.2.1牛主动脉内皮细胞总RNA及mRNA分离提取参照Trizol试剂说明进行RNA提取；参照Z5300磁珠分离mRNA试剂盒操作说明进行mRNA分离提取.1.2.2抑制消减杂交参照文献［4］及SSH试剂盒说明以FiBECcDNA为检测子（Tester），以CnBECcDNA为驱赶子（Driver）.①双连cDNA的合成：取Tester和DrivermRNA各2Pg（4u

8、L）分别与1uLcDNA合成引物混合，在3.3X108nkat/LAMV反转录酶1uL作用下合成第一链cDNA.立即在第一链合成反应液中加入20X第二链酶混合物、dNTP等，16°C反应30min,合成双链cDNA.抽提并沉淀cDNA,将沉淀物溶于50uL灭菌水中.②双链cDNA的酶切：取Tester和Driver双链cDNA各43.5uL，分别用RsaI1.5PL于37°C酶切1.5h.将未经酶切的dscDNA2.5UL与经