acl重建后tgf-β1%2fvegf165共表达基因转染的bmscs促进腱-骨愈合的研究

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1、天津医科大学硕士学位论文日U舌粒细胞集落刺激因子(G．CSF)等来加速和改善腱．骨愈合。这些方法都在某些检测指标上对腱．骨愈合起到了一定的积极作用，但这些方法有一些不足之处：固定材料的组织相容性不好，易造成骨道扩大；骨膜取材不方便，造成组织损伤较大；没有考虑生长因子的不可控性、一过性释放、短暂的作用半衰期、免疫排斥反应和较高的费用，这些不足限制了在临床的进一步扩展应用；许多实验没有力学性能测试，而该指标为检测腱．骨愈合的金标准；进行力学性能测试的实验虽然治疗组力学指标好于对照组，但远不能达到正常韧带的力学

2、性能[9-12]；没有考虑关节内和关节外韧带环境不同对腱．骨愈合的影响，最近有研究指出关节外腱．骨愈合在各方面优于关节内Il引。研究目的、方法采用腺病毒重组的TGF一13l／VEGFl65共表达基因以BMSCs为载体来研究其对重建ACL腱．骨愈合的作用。探讨ACL重建术后以BMSCs为载体的TGF．Bl／VEGFl65共表达基因治疗是否可有效提高腱．骨隧道的新骨生成，促进腱．骨愈合，从而增强其生物力学强度。天津医科大学硕士学位论文ACL重建后TGF．Dl舰GFl65共表达基因转染的BMSCs促进腱．骨愈合

3、的研究前交叉韧带(ACL)损伤是膝关节常见外伤之一，可致关节不稳，影响关节运动功能。随着物质生活的提高，群众体育活动越来越广泛，ACL损伤的患者也逐年增多，ACL也成为常见的运动创伤之一。ACL断裂引起的膝关节不稳称ACL缺损膝，治疗效果不理想将严重影响运动能力或丧失运动能力，晚期导致严重的膝关节病。ACL断裂后需要韧带重建手术来恢复膝关节稳定性，而肌腱移植物在术后要取得最好的稳定效果，就需要腱．骨间的牢固愈合。目前，促进前交叉韧带重建后腱．骨愈合的实验研究越来越多。为了探讨ACL重建术后以BMSCs为载

4、体的TGF．pl／VEGFl65共表达基因治疗是否可有效提高腱-骨隧道的新骨生成，促进腱一骨愈合，我们进行了如下研究。1．对象和方法1．1实验动物新西兰大白兔，3月龄，体重约为2．5Kg，由天津医院动物实验中心提供。1．2主要试剂和仪器DMEM细胞培养液(sigma，美国)胎牛血清(sigma，美国)PBS溶液(由天津医院中心实验室提供)淋巴细胞分离液(上海华精生物技术有限公司)胰蛋白酶(sigma，美国)低分子肝素钠(天津市生物化学制药厂)生物蛋白胶(杭州普济生物技术有限公司)TGF．pl／VEGFl6

5、5重组腺病毒(由天津医院创伤骨科魏学磊博士赠予)氯胺酮(由天津医院动物实验中心提供)速眠新(由天津医院动物实验中心提供)离心机(上海医用设备厂)显微镜(OLYMPUS日本)流失细胞仪(BDFACSAria，美国BD公司)生物力学仪(EnduraTECELF3200，美国)飞天津医科大学硕士学位论文1．3实验方法1．3．1兔BMSCs的获取将新西兰大白兔称重后用氯胺酮(2ml／支)和速眠新(1．5ml／支)，hl的比例混合，以0．2ml／Kg肌注麻醉后，褪去双侧膝关节兔毛，兔仰卧固定于兔台上，消毒，铺洞巾，

6、持16号骨穿针，沿胫骨平台垂直刺入骨髓腔，外接肝素(3000U，0．2m1)润洗过的10ml无菌注射器，抽取骨髓4ml，用PBS溶液洗涤细胞，离心后去上清，底部细胞可加入适量DMEM液，混匀，缓慢叠于等量Percoll淋巴细胞分离液上，以2500r／min的速度离心20rain，分离骨髓单个核细胞，收集界面上的细胞，移入另一离心管，PBS洗涤，2000r／min离心5min，反复2次，弃上清，悬浮于含10％胎牛血清的DMEM培养基，轻轻吹打均匀，接种到25吼2培养瓶，置37℃，5％C02及饱和湿度培养箱中

7、培养。48h首次换液，以后每3d换液1次，14d细胞生长融合达80％以上，细胞贴壁紧密，细胞形态均一呈漩涡状，进行传代。1．3．2兔BMSCs的传代培养弃去原代培养瓶中培养液，以0．125％胰蛋白酶消化，摇匀培养瓶使消化液完全流过瓶底，放37℃温箱中消化1．3分钟。在倒置显微镜下观察细胞间隙变大、细胞皱缩变圆、大部分脱落浮于瓶中即为消化满意，加入细胞培养液终止消化，吸管轻轻吹打贴壁细胞使其完全脱落，细胞完全悬浮于培养瓶中，按1：2比例传代培养，倒置显微镜下逐日观察细胞形态。1．3．3TGF．pl／VEGF

8、l65共表达腺病毒转染BMSCs取第3代BMSCs于培养瓶中长成平层后，以0．125％胰蛋白酶消化，摇匀培养瓶使消化液完全流过瓶底，放37℃温箱中消化1．3分钟。在倒置显微镜下观察细胞间隙变大、细胞皱缩变圆、大部分脱落浮于瓶中即为消化满意，加入细胞培养液终止消化，将细胞接种于直径35mm的6孔板中，24小时后细胞长成单层。去除培养基后分别加入TGF．13l／VEGFl65共表达腺病毒悬液2009l、无血清DMEM培养基200I