抗cd133人源性单克隆抗体的筛选、鉴定与表达

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1、Isolation，identificationandexpressionofspecifichumanCD133antibodiesecilicIIUmanoclleSADissertationSubmittedtoSoutheastUniversityFortheAcademicDegreeofGeneticsBYXIAJing—SupervisedbyProfessorZHANGJianqiongInstituteofLifeSciencesSoutheastUniversityMarch2012学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的

2、研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得东南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：关于学位论文使用授权的说明东南大学，中国科学技术信息研究所，国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文挡的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。论文的公布(包括刊登)授权东南大学研究生院办理

3、。研究生签名：导师签名：III期：≯￡?：元尸摘要抗CDl33人源性单克隆抗体的筛选、鉴定及表达中文摘要CDl33蛋白(prominin．1)属于五次跨膜蛋白--prominin家族，是该家族首个被鉴定的成员。Prominin家族蛋白的功能及其相应配体至今尚不清楚。目前已有大量研究表明CDl33是多种人体肿瘤干细胞表面标志分子之一。CDl33分子已经在人类多种恶性肿瘤中用于分离和富集细胞亚群，该细胞群体能在体外形成克隆，并能在动物体内形成肿瘤。最近研究表明CDl33分子是有价值的细胞表面标志分子，有希望成为新治疗策略中的靶标。目前已有针对CDl33分子的鼠源性单克隆抗体，但由于其鼠源性

4、会产生人抗鼠抗体(HAMA)，并且完整单抗分子过大难以进入肿瘤组织内，使其体内诊断及治疗受到了限制。因此，制备高特异性抗CDl33的人源性单克隆抗体有重要意义。本研究通过原核表达并纯化CDl33分子第二胞外片段(100p1)和第三胞外片段(100p2)蛋白。纯化后的CDl33．100p1．HIS和CDl33．100p2．HIS蛋白经间接ELISA检测显示与鼠源抗CDl33抗体发生特异性结合。以纯化后的CDl33．100p1．HIS和CDl33．100p2．HIS蛋白作为靶分子，筛选TomlinsonI+J文库，获得人源性scFv噬菌体抗体。在筛选抗体库过程中，噬菌体种类、固相介质表面抗

5、原密度或溶液中抗原浓度和清洗时间三个因素对筛选效率影响最大。因本次使用的scFv抗体库为无偏性的天然文库，所以采用了五轮筛选，前两轮采用中等的严密度，避免高亲和力但低表达的噬菌体抗体克隆丢失。后三轮的严格筛选达到了筛选目的。第五轮噬菌体的投入产出率比第三轮增加了42．5倍。将五轮筛选获得的多克隆噬菌体抗体均进行ELISA检测，发现五轮筛选的OD45011111吸光度值逐渐升高。以第五轮筛选后获得的多克隆噬菌体抗体感染宿主菌XLl-blue，挑取其中的单个菌落，制备出101株单克隆噬菌体抗体，用ELISA测定其抗原结合活性，以P／N值>2．1为阳性克隆，共计挑选87个阳性克隆，阳性率为8

6、6．1％。挑取其中6个P／N值>8的阳性克隆做进一步研究。以挑取的6株单克隆噬菌体抗体感染大肠杆菌XLl．Blue，扩增后提取噬菌粒，构建可溶性scFv表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经lmMIPTG诱导后收集菌体周质和包涵体蛋白。ELISA检测证实有1个克隆成功地表达了可溶性的scFv抗体蛋白，可溶性抗体与人CDl33蛋白有特异结合活性。纯化后的scFv．1能够与鼠源CDl33单抗发生相互竞争及抑制作用，说明其识别并结合的抗原表位一致或有一定程度的相互重叠。通过对克隆1的可变区进行序列测定分析与NCBI．BLAST检索，证实其与人免疫球蛋白IgG重链VH3氨基酸同源性为93

7、％，差异主要集中在CDR2、CDR3区，轻链V区与人免疫球蛋白VK1氨基酸同源性为97％，CDRl、CDR2、CDR3区均存在氨基酸差异。根据同一家族中核苷酸序列同源性大于80％，说明所获抗体基因重链属于人抗体VH3家族，轻链属于人抗体VK家族。本研究以噬菌体展示技术得到了人源性抗CDl33的单克隆抗体并初步探索了该抗体的部分生物学特性，为进一步深入研究该人源抗体的生物学功能及应用前景等打下基础。关键词：CDl33肿瘤干细胞噬菌体抗体库人源性单