斑蝥素间接竞争性elisa检测方法的建立及眼斑鞠菁体内斑蝥素的免疫荧光检测

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1、重庆大学硕士学位论文中文摘要摘要眼斑芫菁(均砌6，括Cf如D，引LillIlaeus)，又称为黄黑小斑蝥，是鞘翅目芫菁科昆虫，也是传统的中药动物药。现代的临床学研究发现，眼斑芫菁在治疗癌症和一些疑难杂症方面具有独特效果，其抗癌有效成分就是斑蝥虫体所含的斑蝥素。到目前为止，对于眼斑芫菁体内的斑蝥素的转运、分布等方面的研究和相关报道很少，对其生物合成和代谢机制的研究更是有限。对于斑蝥素的检测方法，国内外早期是采用重量法和酸碱滴定法。近年来，又发展出更加精确的气质联用法、高效液相色谱法以及反相高效液相色谱法等方

2、法。但是这些方法所需的仪器本身价格比较昂贵，且操作复杂，需要专业的技术手段，因此只能应用于实验室的检测。酶联免疫吸附剂测定法因其灵敏度较高、特异性良好、检测便捷且周期短、成本低廉，广泛的应用于蛋白类生物大分子的检测。早期对于缺乏免疫原性的小分子物质，由于不能产生相应的抗体，所以对于小分子物质的检测主要还是依赖于色谱分析，近年来，研究者将小分子物质与蛋白质大分子结合，合成小分子物质完全抗原的方法，获得小分子物质的抗体，使得利用免疫学方法检测小分子物质成为可能。本研究的目的主要就是建立快速、灵敏的斑蝥素的间接

3、竞争ELISA检测方法，并对其检测结果进行评价，为进一步研制斑蝥素检测试剂盒奠定基础。同时利用获得的斑蟊素抗体，以免疫荧光检测的方法研究斑蝥素在眼斑芫菁成虫体内的分布，为进一步研究斑蝥素的合成机制以及芫菁科昆虫体内斑蝥素的代谢途径等提供有力的支持。研究已经取得如下主要结果：①利用已制备的斑蝥素完全抗原，经动物免疫获得多克隆抗体。经过反复优化，建立了斑蝥素的间接竞争性ELISA检测方法。优化后的检测体系为：用含CA．O、後的PBS(pH7．4)包被液包被酶标板，100肛l／孔，4℃孵育过夜。在酶标板中加入封

4、闭液1％明胶(200pl／孔)，置37℃孵育2h。同时加入用pH7．4的磷酸盐缓冲液稀释的斑蝥素标准品和按1：200稀释的一抗各50肛l／孔，37℃下孵育1h，使固定抗原CA．OVA与斑蝥素竞争性地结合一抗。加入HRP酶标记的羊抗兔IgG(用PBs缓冲液1：5000进行倍数稀释)，100“l／孑L，37℃下孵育1h。加入配好的OPD显色液，100“l／孔，于37℃下遮光孵育15min。加入反应终止液体2M浓硫酸，50¨l／孔。最后置于酶标仪中，在492m波长处读数。在此检测体系下，对斑蝥素的检测标准曲线方

5、程为y=一13．421x+102．45，R2=O．988，检测范围为：0．1肛g／ml～24“g／ml。其最低检测下限为O．01¨咖l，批内重庆大学硕士学位论文中文摘要和批间变异系数分别为4．27％和4．56％，检测效果良好。②对眼斑芫菁25日龄成虫经组织解剖，然后进行免疫荧光染色，进而利用荧光显微镜对眼斑芫菁雌、雄成虫性腺各部分、生殖附腺、消化道等主要器官系统中荧光强度进行观察，并利用IPP6．O检测数据和DPS分析。结果显示，在雌虫体内各器官组织中，生殖系统的平均荧光强度要显著性的高于肠道系统，而生殖

6、系统内以储精囊的平均荧光强度为最高。雄虫体内生殖腺和肠道系统以及精巢之间在平均光密度方面存在显著性差异，而肠道系统和精巢在平均光密度值方面不存在显著差异。整个虫体内的组织器官中，以精巢的平均光密度值为最高。雄虫的肠道系统在平均光密度值方面显著的高于雌虫肠道系统，而在生殖系统的比较中，雄虫的平均光密度值也要高于雌虫，但是不存在显著性差异。由此可以推测，眼斑芫菁成虫其主要的斑蝥素储存部位位于生殖系统，同时由雌虫储精囊中光密度值的高表达也可以确信，其体内的斑蝥素主要是来自于雄虫，是通过交配转移而来的。而成虫的肠

7、道系统在平均光密度值方面则仅次于生殖系统系统，说明肠道也有可能是眼斑芫菁储存斑蝥素的部位之一。关键词：眼斑芫菁，斑蝥素，ELISA，免疫荧光，检测重庆大学硕士学位论文英文摘要ABSTRACT蚴砌打括ac矗。胁LirⅡ1aeus，alsol(Ilownastheyellowalldblackcantharis，belongstoColeoptemMeloidaeinsects．ModemclinicalstudiesfoulldthatJjl毋比6厂括C七办D肼Li皿aeushaSauniqueea’ect

8、inthetreatmentofcancerandincurablediseases．Itsanti-callceractiVein伊edientisc舶aridinwhichcaIl也ariscontained．Sof-ar，theresearcha11dr印ortsaboutcanthauridintransitinViVo，distribution，isVe巧1ittle．EVentheirbiosynthesisa11