应用精子载体法生产转sap基因巴马小型猪的初步的的研究

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1、响，重复六次，以比较不同孵育时间对精子活率、平均曲线运动速度(VCL)、平均直线运动速度ⅣSL)、平均路径速度(VAP)、前向性(STR)等试验指标的影响。结果显示孵育1h的精子活率、STR与0h(对照组)比较无显著性差异(p>o．05)，但VAP、VSL和VCL有显著差异；而孵育2h与对照组比较除VsL无显著性差异外，其余各项指标差异均显著。表明外源DNA与精子孵育1h，对精子质量无显著性影响，但孵育2h精子质量显著下降。试验二研究不同DNA剂量对转染后精子质量影响，试验分别加入标记的DNA(1ng／灿

2、)片段o}IL(对照组)、lOIJlL和20IjLL三处理组，试验考查指标和重复数同试验l。结果显示各组精子的活率和运动曲线等均没有显著差异，表明外源DNA的添加对精子质量无显著影响。试验三研究分别加入获能液和对照PBS液(对照组)对转染后精子质量影响，试验方法和指标同试验l，重复六次。结果显示加入受精液后精子各项试验指标均有显著变化。试验四分别用共孵育后的精液和对照组不含外源DNA的新鲜精液进行猪人工授精，以比较转染猪精子的人工授精效果。结果对照组和试验组各有一头母猪妊娠，其中精子共孵育后处理的妊娠母猪

3、虽产下仔猪11头，但经紫外光检测未发现有绿色荧光标记后代。本研究获得如下结论：(1)试验成功构建pEGFP．N1．SAP真核载体并在NlH．3T3细胞中得到转染表达；(2)在精子与外源DNA共孵育过程中，以1h对精子质量效果无显著性影响；(3)外源DNA添加10．20n∥IJLL量对精子质量无显著影响；(4)添加获能液后精子运动速度和活率显著提高，有利于外源DNA进入精子体内；(5)初步建立精子载体法生产巴马小型猪转SAP基因猪技术体系，但其效率还有待提高。关键词：巴马小型猪血清样淀粉P物质转基因猪精子载

4、体法PRELEMINARYsTuDYONTHEPRoDucTIoNoFsAPTRANSGENICBAMAMINI—PIGBYTHESPERMMEDIATEDGENETRANSFERABSTRACTInthisstudymemethodofmolecularcloningalldspe吼medlatedwasusedtoexploret11eef．fect0fsemman搿10idPcomponents(SAP)geneclonmg，recombinantexpressionofeu哪oticplasmid

5、andspennwithexogenousDNAincubationconditionsonthespe肌qual埘，inordertoestablishatecllnlcalplatfornlofproductionofspem-mediatedgenetrallsfer(SMTG)methodmsAPtransgenicB锄amini—pig．Thisthesisincludesthreechapters·Thefirstch印tersisthereviewofliteraturesandthesec

6、ondandthirdchaptersaretne111thesecondchapter，theSAPgenecloningandmeestablishmento置仕坨eukaryoticexpression，transfeCtandidentificationwerec耐edout1nordertoDrovideformenextcha讲ertheexogenousDNA矗贸meproductlonots，蚶t啪sgenicB锄amini-pigbySM[TGmethod．Apairofspecific

7、pnmerswasdesi聃edaCcord吨t0theSAPsequenceinGenBankandthereVerse1)olymeraSechainreaction(I汀一PCI◇wasperf-ormedt0锄p11士ythecorrespondingcDNA仔a肿entusingtheb锄amini。pigliVertissue洲RNAasatemplateandthen也eamlified胁gIllentshowedareStrictionsltesmtheSAPgenewhichwascor

8、nlectedtothepMD18一TVectora11dtransfectedtoDH5abacteria，andthetestedpositivebaCt撕anliquidwassequenced·ThesequenclngresultsshoWedthatthelen酗ofBamamini—pi萨SAPgenef．ragment1s675bp‘Thehomologywasl00％comparedwiththegeneGe