单精子胞质内注射转基因法icsimgt生产转fat基因兔的初步研究.pdf

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1、分类号密级UDC博士学位论文单精子胞质内注射转基因法（ICSI-MGT）生产转Fat-1基因兔的初步研究张顺学科专业动物遗传育种与繁殖研究方向胚胎工程指导教师陆凤花研究员石德顺研究员论文答辩日期学位授予日期答辩委员会主席 广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究

2、工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：□保密，在□不保密。年解密后适用授权。(请在以上相应方框内打―√‖)论文作者签名：日期：指导教师签名：作者联系电话：日期：电子邮箱： 单精子

3、胞质内注射转基因法（ICSI-MGT）生产转Fat-1基因兔的初步研究摘要单精子胞质内注射转基因（IntracytoplasmicSpermInjectionMediatedGeneTransfer，ICSI-MGT）是精子载体转基因中应用最广泛的一种方法，它具有不需要考虑精子的活力、能转移大片段的外源基因和相对于体外受精介导有较高的转基因效率等优点，因此被广泛应用于转基因动物制作研究。本研究以线虫体内克隆获得的n-3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因（Fat-1）为目的基因，系统研究了兔ICSI-MGT转基因效率

4、的相关影响因素和精子/DNA结合的分子机制，并对应用ICSI-MGT生产转Fat-1基因兔的可行性进行了探讨。1、研究了兔精子处理方法对ICSI-MGT转基因效率的影响。结果发现，无抗冻剂液氮长期冻存对精子DNA的损伤程度与一次液氮冻融组相比无显著差异（P>0.05），其受精后的合子双原核形成率（71.4%vs67.5%和77.2%）、卵裂率（76.7%vs79.5%和80.4%）及囊胚率（39.7%vs42.0%和40.2%）与一次液氮冻融组及新鲜精子组相比均无显著差异（P>0.05），但其ICSI-MG

5、T后的阳性胚胎率及囊胚阳性率显著高于新鲜精子组（43.8%vs18.6%；56.1%vs12.8%，P<0.05），而与一次液氮冻融精子组无显著差异（43.8%vs40.2%；56.1%vs46.8%，P>0.05）。比较不同来源精子的ICSI-MGT转基因效率时发现，来自附睾的精子与采集的精子相比，其与外 源DNA结合的效率差异极为显著（DNaseI消化前：77.5%vs17.0%；DNaseI消化后：47.6%vs5.2%，P<0.01)，ICSI-MGT后能获得较高的阳性胚胎率和囊胚阳性率（32.4%

6、vs10.8%；40.2%vs9.2%，P<0.05）；对二者精液的差异成份——精浆进行分析，发现外源质粒孵育精浆后出现降解现象且降解程度随着其含量的升高而逐步升高，当精子/DNA孵育体系中添加EDTA后能显著抑制孵育外源质粒的降解，同时，EDTA处理后的采集精子用于ICSI-MGT生产转基因胚胎，与未添加EDTA对照组相比能显著提高阳性胚胎率及囊胚阳性率（24.5%vs10.8%；36.0%vs9.2%；P<0.05）。上述结果表明：（1）无抗冻剂液氮长期冻存精子可以用于ICSI-MGT操作生产转基因胚胎

7、，为兔精子介导转基因提供了一种方便可靠的精子保存方法；（2）精浆成份存在高活性的脱氧核糖核酸酶能降解外源DNA从而降低ICSI-MGT的转基因效率，添加EDTA能抑制外源DNA的降解进而提高ICSI-MGT的转基因效率。2、探讨了ICSI兔卵母细胞激活与培养对胚胎发育的影响。激活方法对比研究的结果显示，ICSI卵母细胞经5μMIon激活5min后，再用2mM6-DMAP或2mM6-DMAP+5μg/mLCHX培养1.5h，其分裂率高于用5μg/mLCHX培养1.5h的卵母细胞和未激活对照的卵母细胞，卵母细胞

8、激活后用2mM6-DMAP+5μg/mLCHX培养1.5h的囊胚率（41.3%）和一级胚胎率（65.4%）显著高于其它各组的卵母细胞（P<0.05）；胚胎分级后进行常规体外培养，一级胚胎的囊胚率和囊胚细胞数与体内胚胎差异不显著（P>0.05），显著高于二级、三级胚胎（P<0.05）。当在培养液中添加不同浓度的细胞凋亡抑制剂1-磷酸-鞘氨醇（S1P）时，添加50nM或100nM的VI S1P能提高囊胚形成率和囊胚质