鹅脂蛋白脂酶基因外显子4、5和6克隆及其序列的分析的研究

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1、摘要由脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞和巨噬细胞等实质细胞合成和分泌的脂蛋自脂酶(LPL)是一种酰基甘油水解酶，在所有动物体内的脂类代谢和运输过程中起重要作用。本文主要对鹅LPL基因外显子4、5、6和内含子4、5、6序列进行克隆并对其编码蛋白质残基进行分析研究，结果如下：1．利用LPL基因外显子的高保守性，参照鸡的LPL基因序列，设计引物P和Q分别扩增鹅LPL基因外显子4至外显子5和外显子5至内含子6片段。对扩增产物进行，测序，依据外显子和内含子的gt_ag拼接规则，得到鹅LPL基因外显子4、5和6的长度分别为112bp、234bp和243bp以及内含子4、5和6的序列长度分别为：15

2、26bp、187bp和1102bp，结果登录在GenBank，ID：DQl05796和DQl05797。2．利用DNAStar5．0l软件，分析鹅LPL基因外显子4、5、6和内含子4、5、6序列，与其它13个物种的LPL基因序列进行同源性分析，结果显示鹅与鸡的同源性最高(919％)，与其它物种的同源性在74％～78％之间；而内含子同源性较低，差异很大。以外显子4、5和6构建核酸进化树，发现鹅鸡较早地与哺乳类动物分化开来；食草动物和猪、灵长类以及食肉类动物之间在分化上表现出明显的特异性，每类之间分化明显，而类内则较为一致。3．鹅LPL基因外显子4、5和6编码LPL蛋白质中的196个氨基酸。分析该

3、段蛋白质的氨基酸组成，比较不同物种之间的氨基酸序列的同源性，结果表明：鱼类最早分化，然后是鹅鸡、猪、鼠类和哺乳动物的分化。分化越晚的物种，其氨基酸的同源性越高。4．计算鹅LPL基因外显子4、5和6的密码子使用频率，比较不同物种LPL基因外显子4、5和6的密码子使用策略，结果显示不同的氨基酸在该区域采用不同的密码子使用策略，Ala偏爱使用GCU，Arg使用CGC，His使用CAC，Leu使用CUC+CUG，Ser使用AGC，Val使用GUG，Thr使用ACC等，显示出密码子使用的非随机性；比较分析结果显示，鹅密码子使用策略与其它物种有明显的区别，其中鹅与食肉类动物(狗、猫和貂)的密码子使用频率的

4、相似系数较低(小于O．36)，与人、牛、羊和狒狒的相似系数为0．4～0．5，与猪和鼠的相似系数为O．55--0．65，与鸡的相似系数达O．839，表明鸡鹅在该区域的密码子使用策略相似。5．分析该区域氨基酸的亲水性、电荷密度分布和氨基酸特定区域位于蛋白质表面的概率，结果显示氨基酸残基位于LPL表面的区域恰恰是亲水性较强和电荷密度较高的区域，而表面概率较小可能位于LPL沟槽中的氨基酸残基是一些亲水性小、电荷密度小或是负电荷的区域，表明前者是LPL的结合区域，而后者则可能是隐藏有LPL的活化或催化部位的区域。6．运用PCR-RFLP技术，选用限制性内切酶Hinfl、Pstl、PvuII对鹅LPL基因

5、内含子4进行多态性分析。对123个鹅样本的内含子4的PCR—RFLP分析发现存在多个酶切位点，其中Hinfl有2个位点，PstI有3个位点，PⅦII有3个位点，但未发现有多态性。关键词：鹅，脂蛋白脂酶基因，外显子，克隆，序列分析，密码子ⅡAbstractLipoproteinLipase(LPL)，anacylglycerolhydratase，whichissynthesizedandsecretedbytheadiposetissue，cardiacandskeletalmuscles，thelactatingmammaryglandandmacrophages，playsavitalro

6、leinlipidmetabolismandtransportation．ThepapermainlystudiedonthecloningandanalysingofLPLgeneexon4，5，6andintron4，5，6sequenceandtheproteinresidueitcodedingoose，theresultsshowedbelow：1．PrimersPandQweredesignedtoamplifytheLPLgeneexon4toexon5，exon5tointron6refertosequenceoftheLPLgeneinchickenforitshighcon

7、servmion．TheLPLgeneexon4toexon5andexon5tointron6wereamplifiedandsequenced．Accordingthegt-atsplicingruleinexonsandintrons，obtainedtheLPLgeneexon4，5，6whichwere112bp，234bp，243bplongandintron4，5，6ingoosew