金葡菌肽聚糖模拟肽疫苗候选保护性作用的初步的研究

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1、中文摘要抗原，以诱导有效的再次免疫应答，探索以模拟肽作为疫苗候选的可能性。已知，短肽可模拟蛋白与非蛋白(糖、脂等)表位，常用于构象性表位特性以及糖脂类抗原表位研究。近十余年来，已在研究病原生物及肿瘤的非蛋白成份方面做了大量探索，并可用于分析蛋白质折叠中形成非连续性表位的特点。合成肽疫苗的优势是对有效与非必要抗原表位的组合与取舍，而缺点则是免疫原性弱，需设计合适的载体与佐剂。但近年国内的多价抗原肽(MultipleAntigenicPeptide，MAP)技术有了长足的发展，其优势体现在：不需交联载体，可不用佐剂；除抗体反应，还可诱导CTL与Th细胞反应；尤其在不同的分枝上可有

2、不同序列的肽链，可用于构成或模拟更为复杂或不同功能的表位。国外近年已有数个多价肽疫苗进入临床观察。本课题的主要研究思路是：利用噬菌体肽库筛选获得的短肽模拟PGN的保守性结构表位，将其非蛋白抗原表位的性质改变为短肽，由此使TI—Ag改变为TD—Ag；并以所获模拟肽序列合成四分枝多价抗原肽(MAP)作为疫苗候选诱导机体内产生有效的再次抗体应答和保护性免疫。本课题组用抗PGN商品化单抗从噬菌体随机展示肽库中筛选了十余个模拟位克隆，结合生物信息学分析选择三个PGN表位的序列进行修饰与合成，并进行体外间接ELISA与抑制ELISA鉴定，从中选择效果较好的SP31进行四分枝多价抗原肽，并

3、对其免疫原性及免疫效果进行评价。一、应用噬菌体展示技术筛选金葡菌PGN模拟肽克隆从噬菌体线性肽库中筛选可模拟PGN表位的噬菌体克隆以商品化抗PGN单克隆抗体为靶分子对噬菌体线性12线性肽库进行了3轮筛选，富集率达为2千倍以上，显示了明显的富集效果；从第三轮随机挑选49噬菌体克隆中用夹心ELISA鉴定出可与抗PGN单克隆抗体结合0勺a-4-+克隆。阳性噬茵体测序及序列分析将上述14个阳性噬菌体克隆进行DNA测序，并对其氨基酸序列进行分析，其第3l、28、43号克隆具有共同序列：ATWxHxLxSAGL，并与27、39、1序列有保守序YUxnx或Hx，除噬菌体克隆l号博士学位论文

4、外与anti．PGNMcAb均有高反应性(OD450)，第5、23、38、44虽具有共同序列G姗YAAI，黜址S，但多次重复后第5序列非特异性结合较高，可能含有吸板序列；因此，选择3l，27，39三种噬菌体作为后续研究对象。二、PGN模拟肽的设计、合成与体外鉴定阳性克隆展示序列抗原特性分析通过在线软件www．syfpeithi．de，http：／／bio．dfci．harvard．edu／Tools／antigenic．pl，http：／／www．darrenflower．info／mhcpred预测和T细胞表位预测软件(DNAstar)分析发现，三种阳性噬菌体展示序列均具有

5、人和鼠MHC结合表位；其中No．31可能的抗原表位为一TWxHxLx．序列，在两端分别加上SG．、GG后可能具有T细胞表位；No．27可能的抗原表位为一sPHxH000RS一，在两端加上SG／GGG的不同组合后均不具有T细胞表位；No．39可能的抗原表位为一WxHxVxW一；在两端加上不同SG／AGG氨基酸后可能具有T细胞表位，序列分析结果表明三种序列具有构成Th、B细胞表位的特性。但是否真正模拟PGN的抗原表位，还需进一步的生物实验验证。PGN模拟肽抗原性鉴定体外ELISA鉴定结果表明，以生物素标记三种线性合成肽链(SP31，SP27，SP39)能特异结合抗PGN单抗及兔抗

6、＆aureus全菌多抗(Fsml=l139．058，esP3l=0．000；FsP27=196．091，Psr，27=0．000；Fsm9=90．81l，PsP39=0．000)，其中SP31、SP27与抗PGN单抗的反应性优于抗S．aureus多抗，而SP39贝dJ反之；抑制实验表明，PGN能剂量依赖地抑$1JSP31、SP27与抗PGN单克隆抗体结合(席GN抑制sP31=729．036，PPGN抻制sP3l=o．027；Fsnlnms=12．286，PsP3l抻嗣陷N=O．039；FmN抻制sr，27=74．776，PmN抻制sP27=O．001)，抑制效果在40％-60

7、％，而39号合成肽抑制效果较差，量效关系不显著(数据未在文中显示)。上述结果提示SP31，SP27，SP39线性肽可不同程度地模拟PGN表位的抗原性。基于SP31，SP27为模板合成四分枝多价抗原肽(MAP)鉴定表明，MAP．P31齐U量依赖地与抗PGN单抗俨2021．727，P---0．ooo)和抗S．aureus多抗反应(户178．344，P--O．ooo)，并能与PGN相互抑制与抗PGNMcAb的反应(昂GN抑制MAP-P3l--64．032，PPGN抻制MAPP3l-o．015，凡肚P3l删PG