以原核表达的eb病毒融合蛋白p54ztan为抗原建立elisa方法与其在鼻咽癌诊断中的应用

《以原核表达的eb病毒融合蛋白p54ztan为抗原建立elisa方法与其在鼻咽癌诊断中的应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、以原核表达的EB病毒融合蛋白p54．ztaN为抗原建立EUsA方法及其在鼻咽癌诊断中的应用中文摘要目的：构建EB病毒BMRFl．BZLFIN融合基因的原核表达载体，在E．coli中表达p54-ztaN融合蛋白，以纯化后的融合蛋白为抗原建立ELISA方法，开发新的NPC诊断及筛查方法。方法：自EBV阳性细胞(B95．8)中提取总RNA，经逆转录．聚合酶链反应分别获得BMRFI和BZLFlN编码序列的eDNA；通过暑A克隆技术分别构建pGEMT-Easy—BMRFl和pGEMT-Easy·BZLFIN重组质粒：采用重叠区扩增基因拼接技术将BMRFl基因和BZLFl

2、N基因通过柔性接头(GlyaSer)2进行不同次序的融合，构建融合基因BMRFl．BZLFIN，并将其克隆入pGEX．5T质粒构建pGEX5T-BMRFl．BZLFIN重组质粒：将PCR、酶切鉴定及测序鉴定正确的重组质粒，转化入大肠杆菌BL21(DE3)qb，经IPTG诱导蛋白表达，SDS．PAGE、Westernblot检测所表达的蛋白，亲和层析纯化重组蛋白；纯化的重组蛋白直接包被酶标板，优化ELISA检测的条件，用已优化的ELISA方法对鼻咽癌病人、正常人以及其他非鼻咽癌的头颈部肿瘤病人血清中的相应抗体进行检测，进而对检测方法的诊断价值进行评估。结果：获得

3、BMRFl和BZLFIN编码序列的cDNA，并成功构建重组质粒pGEMT-Easy·BMRFl和pGEMT-Easy·BZLFlN,以编码弹性蛋白连接肽(Gly,Ser)2的碱基序列为接头，通过重叠区扩增基因拼接技术成功获得了BMRFl．BZLFlN融合基因；将BMRFl．BZLFlN融合基因插入原核表达载体pGEX．5T中，构建了p54-ztaN融合蛋白的表达系统E．coliBL21(pGEX5T-BMRFl-BZLFIN)；SDS．PAGE显示该表达系统能高效表达出88kDa左右的融合蛋白，分子质量大小与预期一致：经Westernblot实验证实该融合蛋白

4、能很好地与相应抗体结合；用亲和层析法获得了高纯度的融合蛋白；ELISA法检测放射治疗前鼻咽癌病人、正常人以及其他非鼻咽癌的头颈部肿瘤病人血清抗体的OD450平均值分别为1．083、0．303和0．396，放射治疗前鼻咽癌病人组血清抗体水平明显高于正常人组以及其他非鼻咽癌的头颈部肿瘤病人组，P<0．05；鼻咽癌放射治疗前组和放射治疗后组OD450平均值分别为1．083和0．676，两组相比较，有显著性差异，P<0．05：6ROC曲线分析表明，当选OD450值=O．433为cutoff值时，p54．ztaN抗体用于诊断鼻咽癌的敏感性为86％，特异性为83％。结论：

5、EB病毒BMRFl，BZLFlN融合基因可在大肠杆菌中获得高效表达，重组蛋白p54-ztaN具有免疫反应性，纯化后可用作免疫诊断抗原；建立并优化的p54．ztaN融合蛋自作为抗原对血清中相应抗体进行检测的ELISA方法，可以对鼻咽癌进行诊断及大规模筛查；检测鼻咽癌病人血清中p54．ztaN抗体含量可以用于监测放射治疗效果。关键词：EB病毒鼻咽癌BMRFlBZLFlN融合基因酶联免疫吸附试验7DevelopmentofindirectELISAbased011theEBVfusionproteinp54-ztaNwhichexpressedinE．coliand

6、itsapplicationinthediagnosisofnasopharyngealcarcinomaAbstractObjective：ToconstructBMRFl·BZLFlNfusiongoneanditsprokaryoticexpressionvectorandexpressitinE．coilBL21(DE3)．DevelopmentofELISAbasedonantigenofthisfusionproteintoestablishanewserologicalparameterforNPCdiagnosis．Methods：TheB95

7、-8cellswercculturedtillthelogarithmicphase．TotalRNAinB95-8cellswercextracted,andRNAwereretranscriptedint0cDNA．BothBMRFlandBZLFlNwereamplifiedfromB95-8cellseDNA,andwereclonedintopGEM·TEasyvector．ByGoneSeEingtechnique，afusiongonefragmentcontainingBamHIandXhoIsiteswasconstructedbysplic

8、ingBMRFlgoneandBZLF