23个ysnps遗传标记复合检测体系的建立及法医学应用的研究

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1、中山大学硕士学位论文23个Y-SNPs遗传标记复合检测体系的建立及法医学应用研究23个Y-SNPs遗传标记复合检测体系的建立及法医学应用研究专业：法医物证学硕士生：张爱平指导老师：刘超主任法医师中文摘要Y染色体的男性特异性，使其在法医DNA检验和亲权鉴定方面有巨大应用潜力。对轮奸案、强奸案等案件提取的混合检材进行鉴定时，Y染色体遗传标记扩增分型技术更有其特殊的价值，获得的单倍型结果不受女性成分影响。当犯罪嫌疑人样本无法获得时，还可通过取其父系的任何一个男性个体的生物检材作Y染色体遗传标记进行排查分析，达到节约费用，缩小排查范围的目的。当孩子是男

2、孩，亲权鉴定出现疑问或者没有母亲参与时，比较Y染色体遗传标记是一个排除被指控父亲的简便方法。中华民族的家系以父系姓氏为主，海外侨胞、知名人士寻根问祖需鉴定是否为同一父系宗亲，财产继承需鉴定是否具有父系亲缘关系等。检测Y染色体遗传标记显然有其他检验手段无法替代的作用。Y染色体特异性遗传标记的研究，对于人类学家和考古学家是一个重要领域。目前，STR技术被广泛应用于法医个体识别，但是在法医DNA检验中会遇到各种降解检材，潮湿炎热等环境会导致DNA链断裂，DNA片段的完整性受到破坏，这种现象在陈旧的骨骼、腐败的尸体、发霉变质的斑迹检材中尤为常见。荧光标

3、记STR复合检测系统对上述检材往往无法正确分型。当DNA片段发生降解，大片段STR基因座不易检出，容易产生非特异性带，出现优势扩增和基因漏扩等现象，一直是法医DNA检验的主要难题之一。研究新的遗传标记、检测方法十分迫切。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymo印hism，SNPs)是由基因水平上中山大学硕士学位论文23个Y．SNPs遗传标记复合枪测体系的建立及法医学应用研究的单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，其中最少的一种在群体中的频率不少于l％。它包括了人类基因组已知多态性的80％，是最常见的遗传变异类型。从生物遗传

4、和变异的本质分析，sNPs将是一种最能反映群体遗传结构和个体间的遗传差异的标记系统。由于具有可以用PCR方法检测、分析片段更小(45．150bp)、突变率低、可实现高通量、自动化检测等特点，SNPs迅速成为法医学界解决严重降解DNA标本分型的研究热点。Y．SNPs突变率低，相对稳定，通过对Y染色体SNPs单倍型的分析，可进行父子亲缘鉴定，还可以进行兄弟关系、叔侄关系、爷孙关系的父系亲属鉴定。同时Y染色体SNPs分布具有明显的地域性，可用于进行犯罪现场遗留的生物学个体所属群体的推断。2008年，Y染色体协会(TheYChromosomeConso

5、ni啪)报道了599个Y染色体上的单核苷酸多态性(SNPs)位点。目前国内外对Y．SNPs进行高通量检测的研究并不多见，同时还未见针对中国人群的高效的复合检测体系。本课题探讨利用目前法医DNA实验室常用的复合PCR扩增结合荧光标记单碱基延伸(SingleBaSeExtention，SBE)技术和毛细管电泳检测的方法构建一个VSNPs复合检测体系，实现对多个VSNPs位点快速、简单、特异、灵敏、准确的检测，为降解DNA检材的高通量分型提供新的技术手段，通过群体遗传学研究获得广东地区人群的群体遗传学资料，并探讨其在法医学案件检验中的应用。首先根据Y

6、染色体协会的文献筛选出主要分布于东亚人群的单体群及其对应的65个Y-SNP位点，根据文献给出的rs编号在NCBI的dbSNPs数据库(觚p：肌m啊．ncbi．nlm．nih．go“sites／dbSnp)中查找位点的相关信息，结合国内外文献选择30个dbSNP数据库报道在中国人群中多态性较好、侧翼序列稳定的Y-sNPs位点，部分位点信息查看Genbank中的Y染色体序列(h_ttp：肌m啊．ncbi．nlm．nih．goWGenbanUindex．html)。这些位点包括P164、M122、P203、P148、P145、M89、P151、M21

7、6、P128、P157、P149、P131、P199、P123、P191、P201、M111、M199、P130、M9、P132、P200、P197、M119、P136、M134、M175、P163、M324、P198。对30个VSNPs位点进行PCR引物设计和单个Y．SNPs位点的PCR扩增，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和银染技术对单位点PCR扩增产物进行检测。中山大学硕士学位论文23个Y-卵巾s遗传标记复合榆测体系的建立及法医学应用研究随后，通过“加尾”设计不同长度的单碱基延伸引物(单碱基引物的长度20．85个碱基)，利用SNaPsh

8、ot刑试剂盒对每个位点进行单碱基延伸反应及毛细管电泳检测，确定各个位点的迁移距离。去除单位点PCR检测有非特异性扩增的位点M324，无法用单碱基延伸方