整合素β4对人支气管上皮细胞免疫信号传递的影响

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1、原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：速效徊日期：2建L年』L月丛日关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以

2、采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：违盘氧导师签名日期：址年』月匹日本课题受国家自然科学基金资助项目编号：81170024ThisworkaresupportedbyNationalNaturalScienceFundProject：NO．81170024摘要气道上皮作为沟通机体内外环境的第一道屏障，除发挥物理性防御作用，更具有丰富的生物学功能，在气道局部微环境稳态维持中发挥重要作用。越来越多研究认识到，气道上皮的结构完整性

3、缺陷或功能紊乱可能是哮喘和慢性阻塞性肺疾病等气道高反应性疾病的启动环节。哮喘在本质上被公认为慢性炎症性疾病，而Thl／Th2免疫应答失衡学说在哮喘众多发病机制中一直占据主流地位。气道上皮细胞具有抗原呈递细胞的特性，对外表达TOLL样受体(Tonlikereceptors，TLRs)模式识别捕获外来病原菌，对内通过协同刺激分子B7家族将免疫信号传递给T细胞。这在一定程度上影响T细胞免疫平衡和气道局部的免疫状态。整合素134(integrin134)作为形成半桥粒结构的中心组份，介导气道上皮细胞与基底膜的牢固粘附，其正常表达是维持气道上皮细胞“锚着

4、依赖性"生长的重要基础。哮喘患者气道粘膜镜检常有上皮脱落、凋亡。本课题组前期工作已经证实哮喘病人外周血和气道粘膜integrin134的表达均低于健康人群，且integrin134在气道上皮细胞具有促增殖、抑凋亡、抗氧化损伤、减少免疫原卵白蛋白(ovalbumin，OVA)摄取等保护性作用。据此我们假设：integrin134表达缺陷可能是引起气道上皮结构和功能失稳态进而提高哮喘易感性最终导致发病的关键因素。那么，integrinp4是否也能影响气道上皮细胞本身免疫状态从而调节气道局部的免疫应答?本研究拟合成integrin134的特异性小干扰

5、RNA(siRNA)片段，l在人支气管上皮细胞(humanbronchialepithelialcells，HBECs)中沉默integrin134基因表达，观察其对人支气管上皮细胞B7分子家族谱、抗原OVA摄取后TLIⅥ的表达的改变，以及对共培养的人淋巴细胞增殖的影响。以拓宽对integrin134生理功能的认识，进一步阐明哮喘发病机制。第一部分合成特异性integrin134siRNA并瞬时转染至I-IBECs目的：利用siRNA技术抑制integrin134在HBECs中的表达方法：化学合成integrin[34siRNA片段，经脂质体转

6、染人支气管上皮细胞株，采用real-timePCR和Western-blotting验证沉默效率。结果：real．timePCR和Western．blotting结果显示，siRNA片段转染后气道上皮integrin134表达显著下降。结论：筛选的integrin[34siRNA片段可高效沉默人支气管上皮细胞株integrin134基因表达。第二部分IntegrinB4基因沉默对支气管上皮细胞B7HI及B7DC表达的影响目的：观察integrin134基因沉默后HBECs共刺激分子B7家族B7H1和B7DC的改变。方法：运用real—timeP

7、CR和流式细胞术检测integrin134沉默组和对照组B7H1和B7DC的mRNA水平及蛋白水平的改变。结果：real-timePCR结果显示，B7H1和B7DCmRNA在integrinp4沉默后表达明显上调，流式细胞术在蛋白水平的检测也表现出一致的趋势。结论：integrinp4沉默促进人支气管上皮细胞株B7H1、B7DC的表达。第三部分Integrin114基因沉默对人支气管上皮细胞TLR4基因表达的影响目的：观察siRNA靶向沉默imegfinp4对人支气管上皮细胞TLR4基因表达的影响。方法：免疫细胞化学技术(tCC)观察integ

8、rin134沉默的HBECs经OVA刺激后TLR4基因表达的改变。结果：siRNA转染48h可显著抑制HBECs中integrin134的蛋白表达；与