三种蠕形螨组织化学、酶组织化学与山羊蠕形螨酶学、分子生物学地研究

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1、山东大学硕士学位论文三种蠕形螨组织化学、酶组织化学及山羊蠕形螨酶学、分子生物学研究研究生：冯玉新导师：袁方曙教授专业：病原生物学中文摘要目的人体蠕形螨(humanDemodex)寄生于人毛囊、皮脂腺内，可引起痤疮、毛囊炎、酒渣鼻、睑缘炎、脱发等症。山羊蠕形螨∞emodexcaprae)能引起羊皮皮脂腺囊肿，致使板皮穿孔，给畜牧业造成巨大经济损失。目前有关蠕形螨的流行病学及治疗药物的研究较多，而其超微结构、组织化学、致病机理及分子生物学方面的研究因技术瓶颈的限制进展困难。本实验在探索活蠕标本显微处理技术的基础上，建立蠕形螨整体染色法，应用组织化学技术、酶组织化学技术观察两种人体蠕形螨和山羊蠕形螨

2、的形态、内部结构、化学成分、酶及其在体内的分布。应用酶学方法测定山羊蠕形螨体内酯酶及蛋白酶的活性。经方法改良，提取山羊蠕形螨基因组DNA。目的是为今后从染色法、酶学、分子生物学角度研究蠕形螨的结构、生理、分类和致病机理铺平道路。方法用自制刮片加压刮取人额部皮脂；切开新鲜山羊皮下结节取出其中于酪样物；将标本充分浸没于洗涤剂中，在解剖镜直视下，用自制挑螨针将螨从皮脂中分离并反复清洗干净。将洁净活蠕分类置于超纯水中，于一20。C冷冻48小时后，采用自创的蠕形螨整体染色技术染色：用Giemsa染料染色显示内部结构，碘液染色显示糖原，油溶红O染色显示脂类，甲基绿染色显示DNA。采用Gomori法对酸性磷

3、酸酶、碱性磷酸酶进行染色，采用Gomori醋酸一a一萘酯法对酯酶进行染色，采用Tween法对脂肪酶进行染色。在解剖显微镜直视下，将洁净新鲜的山羊蠕形螨置于自制冰冷微型研钵中研磨粉碎，冷冻离心，取上清液为酶源。参照Asperene的方法，以醋酸一旷萘酯为底物，固蓝B盐为显色剂，在600hm波长下测吸光度来测定山羊蠕形螨酯酶活性；制作1％o明胶、1％琼脂平板，打孔，在孔中滴加501．tl酶源，30"C作用4小时后考马斯亮蓝R250染色检测山羊蠕形螨蛋山东大学硕士学位论文白酶活性。用改进法提取山羊蠕形螨的基因组DNA，以琼脂糖电泳及紫外分光光度计进行检测。结果经过组织化学染色后，三种蠕形螨内部结构、

4、糖原、酯类及DNA着色。经过酶组织化学染色，三种蠕形螨体内酸性磷酸酶、脂肪酶所在部位被染成棕黑色，碱性磷酸酶所在部位被染成黑色，酯酶所在部位被染成紫红色。Asperene法测酯酶活性，酶源组吸光度为0．205±0．027，阴性对照组吸光度为O．090±0．008，两组间有显著差异(尺0．01)。以明胶平板法测定山羊蠕形螨蛋白酶活性，考马斯亮蓝R250染色后酶源所在孔周围形成透明环，说明酶源中含有能消化明胶的蛋白酶。用改进的方法，成功用5000条山羊蠕形螨提取出基因组DNA，琼脂糖电泳显示为一高分子量DNA条带，紫外分光光度计检测OD260／OD280大于1．6。结论自创的蠕形螨整体染色法解决了

5、蠕形螨整体染色显示内部结构的问题。发现三种蠕形螨体内含有大量的糖原、酯类和DNA，具有酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、酯酶和脂肪酶活性。山羊蠕形螨体内酯酶及蛋白酶活性较高。这支持蠕形螨以脂类和角蛋白为食的观点，它可能是一种脂螨。同时酶可能是蠕形螨致病的化学物质。成功提取出高质量的山羊蠕形螨基因组DNA。以上创新性工作为今后从染色法、酶学、分子生物学角度研究蠕形螨的结构、生理、分类和致病机理铺平道路。关键词蠕形螨；组织化学；酶组织化学；酶学；基因组DNA；分子生物学2山东大学硕士学位论文STUDYoFHISToCHEMISTRYANDENZYMoHISTOCHEMISTRYOFTHREESPECIESo

6、FDEMoDEXANDENZYMoLoGYANDMoLECULARBIOLOGYoFDEMoDEXCAPRAEGraduate：Advisor：Major：FengYuxinProf．YuanFangshuPathogenicBiologyABSTRACTObjectiveInhumans，DemodexfolliculorumandDemodexbrevishavebeenimpliedtoplayaroleinseveralfacialconditions：aerie，folliculitis，rosacea-likedemodicidosis，baldnessandblephalitis

7、．Demodexcapraemaymakegoatskinsperforatedandgoatskinswilldeclineinprice．AlthoughtherefilemanystudiesofDemodexepidemiologyandmedicineintreatingdemodicidosis，therealefewstudiesofDemodexhistochemistry,pat