脂质体介导精子载体法建立转hbx、突变kras基因树鼩和小鼠动物模型研究论文

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1、硕}：学位论文脂质体介导精了载体法建口转HBx、突变Kras基

2、大l树鼢和小鼠动物模型的研究脂质体介导精子载体法建立转ttBx、突变Kras基因树胸和小鼠动物模型的研究摘要目的在构建重组质粒pcDNA3．1-I--IBx和pEGFP—N，一Kras的基础上，采用直接注射的方法，将脂质体包裹的重组质粒注入动物睾丸中，探讨利用睾丸内生精小管微注射精子载体法建立转HBx、突变Kras基因树嗣的可行性，为建立转HBx、突变Kras基因树鼢肝癌动物模型并进一步研究两种基因在肝细胞癌发生发展过程中的作用打下基础。方法首先用多聚酶链式反应(PCR)扩增含NheIS

3、HKpnI酶切位点的Kras基因序列，对pEGFP-N。载体及Kras基因PCR产物双酶切，用连接酶将两者连接并转化大肠杆菌DH5Q，筛选阳性克隆，并对其进行双酶切和测序鉴定，构建Kras基因真核表达载体pEGFP-N。一Kras：成年雄雌树铜按1：l或l：2配对，根据动物间的适应和受孕情况调整成相对固定的繁殖对。给所有动物建立档案，记录树铜的生产情况，计算母树嗣的总产仔数、平均年产仔数及平均每次妊娠的合笼天数。记录仔动物的每日体重、进食量和健康情况。对仔树嗣用三种方法进行喂养，即配方乳喂养、被动和主动母乳喂养。16只雄性成年树晌随机分为pcDNA3

4、．卜HBx组、pEGFP—N广Kras组、pcDNA3．卜HBx+pEGFP-N，一Kras组和生理盐水对照组，利用脂质体2000包裹已构建的脂质体介导精了载体法建立转HBx、突变Kras基I大

5、树铜和小鼠动物模型的研究pcDNA3．卜HBx矛FlpEGFP—N，一Kras重组质粒，按3：1比例混合(v／w)，DMEM稀释后按分组用微量注射器多位点注射入16只雄性树鼠句睾丸，每周一次，连续注射四次后再隔三周与成年雌性树鼠句合笼自然交配。对合笼交配后4个月内生产的仔树嗣进行肝活检，提取活检肝组织总DNA，PCR技术对基因整合进行鉴定，免疫组化检测其蛋白

6、表达情况。C57BL／6小鼠转基因试验方法同树嗣，剪取一周龄仔鼠尾巴提取总DNA，PCR检测目的基因。结果双酶切pEGFP—N。一Kras后，琼脂糖电泳可分别见到大小约为567bp的片段和几kb的大片断，说明Kras亚克隆入pEGFP—N。，经序列测定其含有完整的Kras基因片段；20个月的实验期内共进行三次转基因后的雄性树踟，均具有正常的繁殖能力，三轮实验观察期内共生产仔树嗣128只，其中成活58只。仔树驹存活率为45．3％；PCR检测128只仔树鼠句肝、肾等组织中的HBx基因，其中4只为阳性(单独注射组3只，联合注射组1只)。PCR产物经DNA测

7、序证实为HBx基因。阳性率为3．57％。EGFP基因均为阴性。经转基因后的小鼠12个月的观察期内共获得HBx基因阳性动物3只(单独注射组2只，联合注射组1只)，EGFP基因阳性动物1只(联合注射组)。对活检肝组织进行常规HE染色和免疫组化检测，显示3只树鼢(E9478、E9242、E9256)部分肝细胞有HBxAgpD性颗粒分布。两只树鼠甸(E9260、E9252)活检肝组织出现EGFP蛋白表达。脂质体介导精了裁体法建谚转HBx、突变Kras基『大1树铜和小鼠动物模型的研究结论成功构建了真核表达载体pEGFP—N，一Kras；睾丸内注射精原细胞介导法

8、构建转HBx基因树鼠句动物模型是可行的，用此方法建立转突变Kras基因树嗣是否可行还需进一步研究。关键词HBx；突变Kras；睾丸生精小管内注射；脂质体；精原细胞；转基因树嗣硕I：学位论文脂质体介导精了载体法建妒转HBx、突变Kras基闪树鼢和小鼠动物模型的研究TheStudyonEstablishingTransgenicTupaiasandmousewithHBx，KrasGenebysperm-mediatedgenetransferABSTRACTObjectiveTherecombinantplasmidspcDNA3．1一HBxandpE

9、GFP—NI—Krascoatedwithliposomeweredirectlyinjectedintothemaletreethrew’Stestis．ToevaluatethefeasibilityofestablishingtransgenictreethrewwithHBxandKrasgenebymeansofseminiferoustubulemicroinjectionandsperm—mediatedgenetransfer，andtoprovideexperimentbaseforinvestigatingtheroleofHBx

10、andKrasgenesinpathogenesisof1ivercancerwithHBV．Methods