鹅圆环病毒elisa检测方法建立与血清流行病学初步调查

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1、』IIIIrlIlllllIIilll／IJ'HlIIIfllllfrlll0Y1713623浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿基茔或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解

2、逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝’江苤堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日致谢光阴似箭，转眼间两年的硕士生涯即将结束。值此论文完成之际，我对培养我的母校、我的导师以及所有支持、关心和帮助过我的人表示诚挚的i身}意。首先，特别感谢我的导师余旭平副教授。余老师渊博

3、的知识、敏捷的思维、严谨的治学态度和孜孜不倦的敬业精神使我获益匪浅，导师注重细节的教导使我受益终身。本论文从实验设计、研究过程到论文的完成无不凝聚着导师大量的心血。同时也感谢导师两年来对我生活和学习中的无私关心与帮助。衷心感谢动物科学学院领导刘建新院长、方维焕副院长、潘炳龙副书记的亲切关怀；感谢教育科王昭荣老师、丁建萍老师的支持：感谢动物预防兽医研究所于涟教授、周继勇教授、杜爱芳教授等指点与关爱。感谢动物传染病实验室的各位兄弟姐妹在实验以及生活上给予我的关心和帮助。他们是：刘晓宁、刘江梅、邬栋栋、

4、竺春、郑冲、张雷、王芳、袁佳杰、黄贤波、谭双、于洪涛、孙宗英及浙江淡水水产研究所的潘晓义、郝贵杰和沈锦玉老师。感谢舍友曲道峰、高辉、倪密陪我一起走过的快乐两年，难忘烦恼时的开导，成功的欢笑，真诚的交流。感谢预防所的其他同窗，不仅实验上给予我帮助，而且是我生活中不可多得的朋友。感谢多年来一直给我无限关爱、支持和信任的父母和姐姐，他们无私的爱是我不断前进的动力，他们永远都是我生活和事业上不断进取的精神支柱!特别感谢石磊女士在我受挫折与失败时，给我的大力鼓舞；感谢长期以来对我的支持与理解!，最后，谨向参

5、加本论文评阅和答辩的专家致以最诚挚的敬意!胡东建2008年5月浙江大学华家池课题来源：国家自然科学基金(编号：30771608)浙江省科技厅重点项目(编号：2007C22047)浙江大学硕上学位论文摘要鹅圆环病毒(GooseCircovirus，GoCV)是近年来发现的圆环病毒科的一个新成员，常潜伏感染，侵染淋巴细胞等增殖速度快的细胞，引起免疫力下降，导致动物对多种条件性致病菌的二次感染易感性增加。2005年本实验室从浙江永康禽流感病死鹅样品中检测到GoCV，并初步分析了浙江省GoCV的分子流行病

6、情况。但现有采用PCR扩增检测的分子流行病学检测方法操作不够简便，特别是较灵敏的检测方法需要通过采集鹅法氏囊组织来制备DNA模板，再进行PCR检测。为调查GoCV的流行情况和感染范围，以及更好地开展GoCV的致病性和免疫机制的研究，本试验开展了GoCV血清抗体检测方法的研究。将本实验室已构建的能融合表达重组GoCV外壳蛋白(△Cap)的质粒pET-28a一△Cap转化到BL21(DE3)，用IPTG诱导表达，优化表达条件。菌体大量培养后，经超声裂解，以包涵体形式表达目的蛋白经洗涤纯化，除去了大多数

7、菌体杂蛋白。包涵体用8M尿素溶解，镍琼脂凝胶柱纯化，SDS．PAGE电泳分析，获得的蛋白纯度达95％以上。将纯化后的变性蛋白直接透析复性，复性率很低(<10％)。通过不同复性条件的摸索，往变性蛋白和复性液中添加0．3％十二烷基肌氨酸钠(SKL)后，先透析去除尿素再透析去除SKL，目的蛋白成功获得高效复性。为获得酶标抗鹅二抗，将用鹅卵黄IgY免疫的兔高免血清，通过辛酸．硫酸铵法进行纯化，经SDS．PAGE电泳检测，纯化的兔IgG其纯度可用于酶标抗体的制备。用HRP一简易过碘酸钠法进行标记，并对酶标产

8、物进行特异性检测。制备的抗鹅二抗不但能与鹅血清蛋白结合还能同其它禽类血清蛋白发生交叉反应，而与哺乳动物(鼠、兔、猪等)血清蛋白不存在明显交叉反应。因此我们设想抗鸡IgG是否也与鹅血清蛋白交叉反应并用于鹅血清抗体的检测。通过直接ELISA及分别用自制的兔抗鹅二抗与羊抗鸡二抗对同一鹅群大肠杆菌抗体检测试验，确定商品化的羊抗鸡二抗可用于鹅血清抗体检测。用纯化复性的ACap蛋白为包被抗原，羊抗鸡酶标抗体为二抗，建立GoCV血清抗体的间接ELISA检测方法。通过对抗原包被浓度、抗体稀释度及各