激素和sb203580对lps刺激小鼠肺泡巨噬细胞分泌tnfα、1l10的影响与分子机制

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1、中文摘要激素和SB203580对LPS刺激小鼠肺泡巨噬细胞分泌TNF．Q、lL．10的影响及分子机制摘要目的：长期以来糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)作为重要抗炎药物用于炎症性肺病(inflammatorylungdisease，ILD)的治疗。ILD是由于炎症、免疫等各种因素导致肺及支气管内大量巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润，释放大量炎症介质产生瀑布级联，进而引起肺内炎性介质和抗炎介质失衡造成的肺脏疾病。脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)，可以通过刺激机体各种免疫细胞产生大

2、量的细胞炎性介质，进而诱发ILD。肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophages，AMs)是LPS的主要效应细胞，释放内源性炎症因子产生瀑布级联是导致炎症发生、发展的根本原因。信号转‘导转录激活子．3(Signaltransducersandactivatorsoftranscription一3，STAT3)的激活在调控ILD起着关键的作用。抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen．activatedproteinkinase，MAPK)信号转导通路能减少致炎症细胞因子的释放。本实验以小鼠AM为研究对象，观察激素与

3、p38MAPK特异性抑制剂SB203580对LPS刺激的上述细胞分泌TNF．Q、IL．10的影响，分析两者是否存在协同作用并进一步探讨STAT信号途径在其中的作用，为临床应用激素及p38MAPK抑制剂治疗ILD提供理论基础。方法：1．ELISA检测LPS刺激细胞上清液中的TNF．a浓度。培养MH．S细胞株，调节细胞浓度到1x106／ml，于24孔板中培养过夜，随机分组：①对照组：加入与各实验组体积相同的无血清RPMll640培养液；@LPS+Dex组：终浓度为1×10击mol／L的DEX预孵育2h后LPS刺激2h、6h

4、、12h；@Dex组：终浓度为1×10而mol／L的DEX刺激2h、6h、12h；@Dex+SB203580+LPS组：终浓度为1×10。6mol／L的DEX预孵育2h后，终浓度为10lamol／L的SB203580预孵育20min后LPS刺激2h、6h、12h；@LPS+SB203580组：终浓度为1Olamol／L的SB203580预孵育20min后LPS刺激2h、6h、12h；@LPS组：终浓度为lOOng／ml的LPS刺激2h、6h、12h。中文摘要各组细胞刺激成功后取上清液，ELISA测定细胞上清液中TNF—

5、Q的含量。2．ELISA检测LPS刺激细胞上清液中的IL．10浓度。方法及分组同TNF．0【测定。3．免疫细胞化学法检测MH．S细胞中P．STAT3的表达。将MH．S细胞于24孔板中进行爬片，调节细胞浓度到1×106／ml，培养过夜，随机分组：①对照组：加入与各实验组体积相同的无血清RPMll640培养液；②LPS+Dex组：终浓度为1×10击mol／L的DEX预孵育2h后，LPS刺激30min；③Dex组：终浓度为1×10。6mol／L的DEX刺激30min；④Dex+SB203580+LPS组：终浓度为1×10击m

6、ol／L的DEX预孵育2h后，终浓度为1011mol／L的SB203580预孵育20min后，LPS刺激30min；⑤LPS+SB203580组：终浓度为1Olamol／L的SB203580预孵育20min后，LPS刺激30min；⑥LPS组：终浓度为100ng／ml的LPS刺激30min。各组MH．S细胞刺激成功后，用免疫细胞化学法检测各组细胞中的p-STAT3表达变化。4．Westernblot方法检测MH．S细胞内P．STAT3、STAT3的表达。实验分组同免疫细胞化学法，于6孔板中上述各组细胞刺激成功后收集细胞

7、，检测细胞内P．STAT3、STAT3表达。数据以均数4-标准差(i±置)表示，各组比较用单因素方差分析(OnewayANOVA)，各组之间进一步用Student．Newman．Keuls(SNK．q)检验进行两两比较分析是否有显著性差异，P<0．05表示有统计学意义。结果：．1．细胞上清液中TNF．0【含量的变化：LPS刺激MH—S细胞后，细胞上清液中TNF．0【含量在2h已经开始升高，6h达高峰，12h稍下降，与对照组比较差异有统计学意义(P

8、组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P