toll样受体4基因干预抑制动脉粥样硬化的机制的研究

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1、原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：碰E1期：型Z!堑三歹关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影

2、印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签每∥翘坠导师签名：挫日期：业山东大学博士学位论文TolI样受体4基因干预抑制动脉粥样硬化的机制研究博士研究生博士生导师王颖张运院士中文摘要背景动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的病理基础。研究表明，伴有免疫反应的炎症过程贯穿于动脉粥样硬化的始终。炎性细胞如T淋巴细胞和巨噬细胞在动脉粥样硬化病变的进程中扮演了重要角色．血管内皮细胞、平滑肌细胞及外膜的成纤维细胞和肥大细胞均可作为免疫细胞产生促炎细胞因子。但在动脉粥样硬化疾

3、病的发生和发展中。对其发病分子机制至今尚未阐明。近年来认为免疫应答，在AS的发生发展中起重要作用，特别是晚近对天然免疫在AS中的作用的研究成为新的研究热点。已知人类具有天然和获得性两个免疫识别系统来抵御潜在的有害物质。获得性免疫系统特异性识别环境中存在的独特抗原决定簇。天然免疫是机体抵御微生物的第一道屏障，识别被称为病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMP)的高度保守抗原域。Toll样受体(Toll．1ikereceptor,TLR)识别种类繁多的PAMP,属于模式识别受体。目前

4、为止，人类TLR家族至少有10名成员已被发现。不同的PAMP活化人类TLR家族的不同成员。TIR通过与内、外源性配体结合，激发天然免疫和获得性免疫应答，启动促炎因子的释放，导致炎症反应的发生，在炎症反应的信号转导系统中发挥极其重要的作用。实验发现：TLR调控胆固醇代谢、炎症和免疫反应、细胞凋亡、斑块稳定性以及血管重塑等病理过程，而这些贯穿于AS病程始终。因此，本研究认为TI晨将为动脉粥样硬化疾病的治疗提供一个新的靶点。虽然近年来国内外学者在TLR4与AS的相互关系研究中已取得很大的进展但仍存在许多重大问题亟待解决：①既然TLR在AS形成和

5、斑块破裂中扮演重要角色，而动脉粥样硬化斑块病变处的巨噬细胞和内皮细胞以表达TLR4为主，山东大学博士学位论文能否通过封闭TLR4基因表达阻止AS进程并降低AS斑块的易损性。这构成本课题的主导思想。②目前造成基因失活的方式主要有反义寡核苷酸技术、核酶或核酸技术、三链DNA技术、单克隆抗体等。反义技术虽能抑制“有害”基因的表达而造成基因失活，但由于反义RNA的选择设计难度较大、反义RNA与mRNA的亲和力及其结合的特异性受到结合位点两侧序列的二级或三级结构的影响、反义寡核苷酸的多聚阴离子性质会引起一系列副作用等问题，故反义RNA目前只应用于恶

6、性肿瘤、病毒感染等疾病。三链DNA技术是将脱氧寡核苷酸与双螺旋双链DNA专一性序列结合形成三链DNA，达到阻止基因转录或DNA复制的目的，此脱氧寡核苷酸称为三链DNA形成脱氧寡核苷酸(Ⅱ’o)，这一技术存在稳定性差、半衰期短的缺点，而且TFO必须与同聚嘌呤同聚嘧啶片段结合，而这样的DNA片段在真核细胞中很少。同样，利用单克隆抗体封闭治疗亦存在半衰期短等缺点。能否找寻一种有效的方法对基因进行干预．③针对TLR4的基因干预与药物治疗谁能在炎性信号转导通路和斑块易损性中起“闸门”作用，它们各自的机制如何?因此，本课题率先开展了封闭TLR4基因阻

7、止AS进程，稳定易损斑块的机制研究，并取得了一定研究成果。目的1．建立TLR4基因砌蛆干扰载体并转染细胞筛选阳性克隆细胞；2．体外对比研究TI取4．RNAi与阿托伐他汀药物干预抑制TLR4基因继而引起细胞生物学行为和相关基因的表达变化，并探讨其机制；3．体外对比观察TLR4-RNAi与阿托伐他汀药物对TLR4信号通路诱导炎症反应的作用，为在体研究提供分子生物学依据；4．动物实验对比研究RNAi与药物封闭TLR4基因对阻止AS进程，降低动脉粥样硬化斑块易损性的作用机制并评估其治疗效果。方法1．RNA小分子干扰表达载体的构建筛选I．1有效封闭

8、TLR4表达的小分子干扰RNA载体的构建设计、合成两对特异性针对TLR4基因的小分子干扰m雌序列，同时设计与人类所有已知基因序列均无同源性的片段作为阴性对照，以pRNAT-U6．1neo为母本