富硒灵芝中水溶性硒蛋白纯化表征及其生物活性的研究

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1、中国农业大学博士学位论文中文摘要捅要本论文以富硒灵芝子实体为原料，比较了四种蛋白提取物(水溶、盐溶、醇溶、碱溶)的氨基酸组成、蛋白质分布、糖含量、硒含量及自由基清除活性的差异。结果表明：水溶性、盐溶性和碱溶性粗蛋白的氨基酸整体分布不存在差异，而醇溶性粗蛋白同其它三者间存在较大差异。水溶性粗蛋白具有最高的硒含量、最多的蛋白种类及最为宽泛的分子量范围、最强的自由基清除活性，碱溶性蛋白则具有最少的糖含量。自由基清除活性从低到高的顺序为：醇溶<盐溶<碱溶<水溶。每种粗蛋白对自由基的清除率与蛋白浓度之间的关系可用对数方

2、程表示，它们的硒含量趋势与抗氧化性趋势间具有较好的一致性，蛋白分布和氨基酸组成等也是影响抗氧化性的重要因素，并且它们之问不存在抗氧化协同作用，因此选定富硒灵芝水溶性硒蛋白作为进一步研究的对象。以蛋白质结合的硒量和自由基清除活性为指标，依次采用硫酸铵沉淀、离子交换树脂层析、分子排阻层析等方法对目标蛋白进行纯化。结果表明：选择80％作为沉淀蛋白质的硫酸铵饱和度，得到粗蛋白的硒含量是1．884mg／g，纯化产率为12．63％；经过QSepharoseFastFlow强阴离子交换树脂初步纯化的蛋白的硒含量是2．835

3、mg／g，纯化产率为1．476％，纯化倍数为118．1倍：经过SephadexG．100葡聚糖凝胶进一步纯化的蛋白命名为Se-GL．P，硒含量是4．87mgCg。纯化产率为0．8941％，纯化倍数为203．7倍，此蛋白达到电泳纯度，并显示出一定的抗氧化活性。硒蛋白的抗氧化活性随着蛋白质结台的硒量增加而增强，显示了富硒灵芝硒蛋白在发挥抗氧化作用过程中硒与蛋白间的协同作用。对该蛋白质的结构进行初步表征的结果表明：Se—GL-P是一种硒蛋白，其中31．275％的se是以硒代半胱氨酸形式存在的，68．725％的se是

4、以硒代蛋氨酸形式存在。Se-GL．P是具有一个亚基的蛋白，分子量是36，600Da，等电点是4．ol，糖含量为19．8％，硒含量是4．87mg／g，N．末端的氨基酸序列为D1NGGGATLPQKLYLTPDVL。Se．GL．P是一种新蛋白质，属于DING蛋白家族中的一员。Se，GL，P体外抗氧化活性、免疫调节活性和抗肿瘤活性的研究结果表明：Se-GL．P具有很强的羟自由基(rio·)和超氧自由基(02-·)清除活性，清除率与Se43L-P之间存在剂量依赖关系，表现为对数回归关系；在相同的蛋白浓度下，Se-GL

5、．P的02一·清除率高于对HO·的清除活性。纯化得到的Se．GL．P的抗氧化活性约高于未经纯化的粗蛋白3倍。Se．GL．P的低中高剂量组均具有一定的促T、B淋巴细胞增殖活性，对小鼠NK细胞杀伤活性也具有很大促进作用。然而，Se-GL．P却不能刺激小鼠巨噬细胞产生产生更多的免疫因子TNF．n。样品免疫调节活性由弱到强的顺序为：Na2Se03=BSA+Na2Se03

6、肿瘤活性，在100¨g／mL浓度下，具有抑制HL-60人白血病细胞、BGC．823人胃癌细胞、Bel．7402人肝癌细胞和KB人鼻咽癌细胞增殖活性，抑制率分别达到46．5％、46．3％、45．58％平¨4355％。从本文的结果可以看出，寓硒灵芝硒蛋白具有较高的生物学活性，所以寓硒灵芝蛋白可作为一种新的高生物活性成分进一步深入研究平lI推J’应用。关键词：富硒灵芝子实体．硒蛋白，纯化，性质表征，生物活性ABSTRACTThehymenophoreofSe-enrichedGanodermaLucidum(Se-

7、GL)wastheexperimentalmaterialinthispaper．Thedifferenceamongaminoacidcompositions，thedistributionofproteins，thecontentofsugar,thecontentofSelenium，andthescavengingactivityonradicalsoffourkindsofcrudeproteinsweredetermined．Thefourkindsofproeinswerewatersolubl

8、ecrudeprotein(SeGLPr(H20))，saltsolublecrudeprotein(SeGLPr(NaCI))，ethanolsolublecrudeprotein(SeGLPr(EtOH))andalkalisolublecrudeprotein(SeGLPr(NaOH))．Resultsshowedthatnosignificantdifferencebetweentheami