rna干扰技术阻断黏着斑激酶表达对肝星状细胞黏附和迁移的影响

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1、英文缩写DEPCECMEGFPFAKFRNKFCMFNGAPDHHSCs10DPAGEPMSFReal．timeQ．PCRR心RISCSDSsiRNAshRNAa．SN队EnglishabbreviationdiethylpyrocarbonateextracellularmatrixEnhancedgreenfluorescentproteinfocaladhesionkinase眦relatednon．kinaseflowcytometryfibronectinG1yseraldehyde一3-phosphateDehydrogenaseh

2、epaticstellatecellsIntegratedopticaldensityPolyacrylamidegelelectrophoresisPhenylmethylsulfonylfluoride焦碳酸二乙酯细胞外间质增强型绿色荧光蛋白黏着斑激酶黏着斑激酶相关非激酶流式细胞术纤维连接蛋白3．磷酸甘油醛脱氢酶肝星状细胞累积光密度聚丙烯酰胺凝胶电泳苯甲基磺酰氟real．timequantitation实时荧光定量PCRPCRRNAinterferenceRNAinducedsilencingcomplexsodiumdodecylsulf

3、ateshortinterferingRNAShorthairpinRNAa．smoothmuscleactinRNA干扰RNA诱导的沉默复合物十二烷基硫酸钠小干扰RNA短发卡RNAa．平滑肌肌动蛋白12河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺一魏稚一名搿嚣嚣：嘲研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名。守劣艳导师签名月乌}Et中文摘要RNA干扰技术阻断黏着斑激

4、酶表达对肝星状细胞黏附与迁移的影响摘要肝纤维化(hepaticfibrosis，HF)是多种致病因子引起慢性肝病，进而发展为肝硬化的共有病理改变和必经途径，如能阻断、减轻乃至逆转肝纤维化，就能在很大程度上改善肝病的预后，因而这一课题也引起了国内外学者的广泛关注。肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSCs)活化、增殖、迁移进而合成大量的胶原等细胞外间质(extracellularmatrix，ECM)成分是肝纤维化形成的中心环节。因此，抑制HSCs活化、迁移、增殖或诱导其凋亡是逆转肝纤维化的关键所在。细胞迁移是机体正常生长发育

5、以及组织损伤、修复和炎症反应必不可缺的病理生理过程，在肝组织损伤及肝纤维化形成过程中，损伤局部大量HSCs聚集可能与HSCs的定向迁移有关，在此过程中又受到一系列复杂的细胞因子的网络调节。黏着斑激酶(focaladhesionkinase，FAR)是整合素信号通路的关键信号分子，多项研究表明其在成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及多种肿瘤细胞的黏附、迁移中发挥关键作用，但对HSCs黏附、迁移的影响知之甚少。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是目前最有效的基因沉默技术，能特异性抑制靶基因的转录，进而下调相应蛋白水平及功能。为此，

6、我们采用RNAi技术，从HSCs迁移入手，以FAK为切入点，构建了靶向FAK的RNAi序列，在阳离子聚合物中文摘要介导下将干扰质粒瞬时转染HSCs，研究特异性阻断FAK表达对纤维连接蛋(了(fibronectin，FN)束IJ激的HSCs黏附、迁移的影响及其机制。实验内容包括以下两部分：第一部分：靶向FAK特异性RNA干扰重组体的构建及筛选目的：利用pEGFP质粒构建靶向FAK的短发卡RNA(shRNA)：t=扰重组体，并通过转染HSCs筛选有效的干扰序列。方法：利用在线设计软件，分别设计两对针对FAK的有小发卡结构的两条DNA序列及一对非特异

7、对照序列，经退火成互补双链，再克隆至带有U6启动子及增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的质粒pEGFP中，构建重组体，转化大肠杆菌(DH5a)菌株，提取质粒进行酶切鉴定后，进行测序分析。体外培养HSCs，并以FN刺激HSCs增殖，在阳离子聚合物梭华．SofastTM介导下，将构建成功的3组重组体转染大鼠肝星状细胞系HSC．T6。采用荧光显微镜及流式细胞仪分析转染效果；通过real．timeQ．PCR技术检测各组FAKmRNA变化，Westernblot技术检测FAK蛋白表达情况，筛选出

8、有效抑制FAK表达的序列。实验分6组：①空白对照组(简写为Con)；②FN刺激组(简写为FN组)；③转染试剂组(简写为Sofast组)；@pEGFP．