人骨髓间质干细胞和胚胎嗅鞘细胞联合移植治疗大鼠脊髓损伤实验的研究

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1、中山大学硕士学位论文人骨髓问质干细胞与胚胎嗅鞘细胞联合移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究人骨髓间质干细胞与胚胎嗅鞘细胞联合移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究专业：硕士研究生：导师：病理生理学朱文标邓宇斌教授摘要研究背景：脊髓损伤是常见创伤，已经成为青壮年残疾、丧生劳动力的重要原因之一。脊髓损伤目前治疗的主要手段有药物治疗，手术治疗及康复训练。药物治疗主要针对减轻既发性损伤，目前有效药物种类少(目前临床常用并获得较广泛共识的仅为糖皮质激素类和神经节苷脂)，强调药物应用的时效性，如损伤后8小时内大剂量甲基强的松龙是唯一经美国食品及药物管理局(FDA)批准并通过III期临床试验的药物

2、。复位，减压，固定以维持脊柱的稳定，避免不适当的搬运方法及治疗手段造成脊髓的二次损伤及持续损伤是手术治疗首要解决的问题。手术治疗的另一方面是通过移植具有治疗作用的种子细胞，促进脊髓损伤的功能恢复。康复治疗的目的是挖掘其自身潜力，最大限度地发挥残存功能，提高患者的生存质量。脊髓损伤后造成损伤平面以下的肢体瘫痪是目前治疗上面临的最重要问题。目前认为移植具有治疗作用的种子细胞是这方面最有可能取得突破的方法。骨髓间质干细胞(marrowmesenchymalstemcellS，MSCs)与嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells，OECs)是近年来倍受人们关

3、注的候选种子细胞。骨髓间质干细胞从骨髓中分离，来源丰富，在体外培养能保持其多向分化潜能，可在脊髓损伤处长期存活并可向神经细胞方向分化替代丧失神经元参与重建神经传导通路，但仅在脊髓损伤微环境诱导下分化为神经元的数量很少，限制了其更好的发挥修复功能；经体外定向诱导为神经元样细胞后，细胞凋亡、死亡大量增加，植入体中山大学硕士学位论文人骨髓问质干细胞与胚胎嗅鞘细胞联台移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究内后存活细胞很少。嗅鞘细胞是存在于嗅球的最外两层以及嗅黏膜上皮中的一种特殊的大胶质细胞，在嗅神经终生再生或修复中发挥重要功能，在一定程度上可促进脊髓损伤神经再生及轴突的髓鞘化。新的观点

4、认为嗅鞘细胞在嗅觉系统中，不仅可通过分泌神经营养因子促进嗅神经元的存活及再生，而且可与嗅觉系统的干细胞相互作用，促进干细胞向嗅神经方向分化，促进嗅神经的成熟。最近王葵光等发现嗅鞘细胞可以促进神经干细胞向神经元的分化，沈慧勇等认为嗅鞘细胞可以启动与之共培养的骨髓问质干细胞向神经元分化的程序。因此本实验研究联合移植人骨髓间质干细胞与胚胎嗅鞘细胞对脊髓损伤修复的治疗效果。目的：观察人骨髓间质干细胞与胚胎嗅鞘细胞联合移植治疗脊髓损伤的治疗效果，探讨共移植的嗅鞘细胞对脊髓骨髓间质干细胞源性细胞分化的影响。方法：从成人骨髓分离培养人骨髓间质干细胞，从流产胚胎嗅球分离培养人胚胎嗅鞘细

5、胞。60只sD大鼠采用ALLEN法制作脊髓急性损伤模型，随机分为四组：骨髓问质干细胞移植组，嗅鞘细胞移植组，联合移植组，PBS移植对照组，在损伤局部移植相应细胞。采用BBB后肢功能评分比较大鼠后肢功能恢复情况；运动诱发电位潜伏期评估脊髓传导性能改善情况；细胞移植5周后，采用组织学方法分析脊髓病理改变、轴突再生、植入嗅鞘细胞和骨髓问质干细胞的存活与分化情况。结果：1．骨髓问质干细胞来源丰富，可从骨髓中分离，一般培养条件下易大量扩增，传代培养生物学特性稳定，保持多分化潜能；嗅鞘细胞取材于经水囊引产的胚胎嗅球，而药物引产的胚胎分离培养不易成功，故嗅鞘细胞来源明显受限，且一般培

6、养条件不易大量扩增，细胞易老化。两者均不表达与移植免疫排斥发生密切相关的细胞表面抗原。2．BBB后肢功能评分从第1周起所有治疗组均比对照组高：第2周起联合移植组比其他组高，骨髓间质干细胞组比嗅鞘细胞组高。3．颅磁刺激运动诱发电位检测，在第l周末，仅3只鼠引出诱发电位，第2周所有大鼠均恢复，潜伏期明显延长。第2周一4周，潜伏期随时间有所回复，各组动物潜伏期比前一星期回复明显，第4周一5周各组潜伏期不再随时间而II中山大学硕士学位论文人骨髓问质干细胞与胚胎嗅鞘细胞联合移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究明显回落，基本维持稳定；第2周一5周，联合移植组比其他组潜伏期回复明显，骨髓间

7、质干细胞组与嗅鞘细胞组均比对照组恢复明显，但两组间差别没有显著性。4．组织病理改变分析。卜2周HE染色可观察到脊髓损伤处灰质内大面积出血；神经元萎缩，胞质收缩；白质轴索变性，坏死，成空泡样改变；大量小胶质细胞结节样增生，大量炎性细胞浸润等改变。细胞移植后5周HE染色可观察到脊髓结构破坏，损伤中央及毗邻区大量神经元萎缩，消失：偶可见胶质细胞结节样增生；灰白质分界模糊变等。各组大鼠均可存在上述改变理改变没有明显的区别。可见囊性软化灶，轴索变性，空泡样改个体差异较大，程度略有不同，各组病5．再生轴突的观察。甘氨酸银浸镀法染色，对照组脊髓损伤区近