骨髓源神经干细胞移植联合gdnf治疗脊髓损伤的实验的研究

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1、博士学位论文骨髓源神经干细胞移植联合GDNF治疗脊髓损伤的实验研究博士研究生：袁军指导老师：徐如祥教授摘要脊髓损伤是一种严重的伤病，其致残率与致死率非常高。对于脊髓损伤的传统治疗方法有脊柱骨折脱位的复位固定、解除脊髓压迫、对症及康复治疗。近年来，随着神经病理生理及神经发育学研究的不断深入，神经组织细胞移植逐渐应用于脊髓损伤的治疗并取得了肯定的效果。神经干细胞(Neuralstemcells，NSCs)特别是骨髓基质细胞源性神经干细胞分化调控和移植修复中枢神经系统功能损害亦成为研究重点。骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BM

2、SCs)是骨髓细胞中除去造血干细胞之外的细胞部分，目前已证实骨髓基质细胞在特定的培养条件下可分化成多种细胞，如间充质细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞和神经元及神经胶质细胞等，具有克隆样增殖特性。其多潜能性的发现和向神经细胞方向定向分化的成功，为神经干细胞的来源增加了一个新的途径，也为解决“自体源神经干细胞”移植方案中细胞数量不足的问题提供了新的思路。胶质细胞源性神经营养[酹(glialcellline—derivedneurotrophicfactor,GDNF)是一种新型的神经营养因子，属于TGF—P超家族成员，

3、于1993年由Lin等首先从大鼠B49细胞系的上清中分离纯化得到。GDNF是目前为止发现的在体外支持运动神经元生长最有效的神经营养因子之一，不仅能挽救发育过程中运动神经元的程序性死亡，还可以促进脊髓损伤后皮质神经元的存活。近年来发现，GDNF除了对中脑多巴胺能神经元具有营养保护作用外，还对感觉神经元和运动中文摘要神经元有不同程度的营养保护作用。本研究通过建立体外、体内实验模型等手段，对骨髓基质细胞源性神经干细胞(Bonemarrowstromalcells．derivedneuralstemcells，BMSCs—D-NSCs)的体外扩增、定向分化

4、、移植及其所移植细胞在损伤脊髓内的存活情况等进行研究，以进一步了解BMSCs—D．NSCs的生物学特性，并探讨其在脊髓损伤应用的可行性和有效性。第一部分：BMSCs体外诱导分化成神经元样细胞的实验研究目的：研究SD大鼠BMSCs体外培养及诱导分化为神经元样细胞的可行性。材料及方法：1．以SD大鼠为实验对象，无菌条件下获取大鼠骨髓，梯度密度离心获取BMSCs。2．在体外应用神经干细胞培养基(专利号：ZL02134314．4)和细胞因子进行BMSCs向神经干细胞、神经元样细胞的诱导分化。细胞培养中分别加入维甲酸(retinoicacid，RA)、胶质细

5、胞源性神经营养因子(Glialcellline—derivedncurotrophicfactor,GDNF)、脑源性神经营养因子(Brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)等细胞因子。3．CK2型倒置相差光学显微镜(OLYMPAS，JAPAN)追踪观察细胞生长情况并拍照；采用SABC法进行免疫细胞化学鉴定。结果：1．大鼠BMSCs能在体外培养中增殖分化为神经干细胞、神经元样细胞。培养48小时后细胞有分裂现象，7d后可见细胞克隆团。12d后大而圆细胞有出芽，16～21d细胞进一步分化出长突起，大多数长突起细胞呈现出典型

6、神经元样细胞，并交织成网。II博士学位论文2．经免疫细胞化学鉴定，培养7～14d的神经干细胞可特异性表达神经巢蛋白(Nestin)：经培养20d的神经元样细胞分别见成熟神经元特异性烯醇化酶fneuron—specificenolase，NSE)和神经核蛋白(neuronspecificnuclearprotein，NeuN)的表达。结论：大鼠BMSCs是具有较强的自我更新能力和多向分化潜能的细胞，在一定条件下，可分化为神经干细胞并进一步分化为神经元样细胞，表达神经组织细胞抗原。RA和GDNF在BMSCs向神经元样细胞分化的过程中起着积极作用。BMS

7、Cs可作为神经干细胞的种子细胞。关键词：骨髓基质细胞神经干细胞细胞培养第二部分BMSCs．D．NSCs移植兼用GDNF修复脊髓损伤的实验研究目的：研究BMSCs—D．NSCs移植兼用GDNF对损伤脊髓的修复作用。材料及方法：1．用半横断法制作脊髓损伤动物模型；2．将实验动物分为4组：A组：单纯脊髓损伤组：B组：脊髓损伤+GDNF组；c组：脊髓损伤+移植NSCs组；D组：脊髓损伤+移植NSCs十GDNF组：另设假手术组以为正常对照。3．以：特有绿色荧光蛋白的质粒转染BMSCs，进行移植细胞的追踪观察；4．手术后应用行为学(BASso，Beattie，

8、andBresnahanlocomotorratingscale，BBB评分)、组织形态学观察损伤脊髓功能恢复情况：应用免