tcrγ9δ2 cdr3δ结合肿瘤抗原分子基础与肿瘤反应性tcrγ9δ2移植人源化抗体抗体片段抗肿瘤作用地研究

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1、北京协和医学院博Ij研究牛论文中文摘要TCR谚)／82结合肿瘤抗原的分子基础及肿瘤反应性TCRy9／52．移植的人源化抗体／抗体片段抗肿瘤作用研究博士研究生：郭阳督’师j。’何维教授、崔莲仙教授尽管T细胞受体(TCR)V82T细胞仅占外周血T细胞的2～5％，然而其显著的抗肿瘤作用却一直备受关注。研究表明，V62T细胞在体内外对多种肿瘤细胞都具有显著的杀伤活性。近年来，我们实验室对TCR79／82识别的肿瘤抗原配体及其识别肿瘤抗原的分子机制开展了较系统深入的研究，并取得了一些学术成果。本实验室在前期-T作中获得了一个卵巢癌反应性的TC

2、RCDR36序列，命名为OT3。通过人工合成的OT3肽与靶细胞、靶组织的结合实验，我们证明了CDR38是TCRy9／82与肿瘤抗原结合的关键部位。为了阐明CDR38与肿痛抗原结合的分子基础，曾将OT3肽的V、D和J区随机突变，比较了其与突变体与肿瘤抗原结合的变化，结果发现CDR38的侧翼序列在TCR仁)／82与肿瘤抗原结合中起关键作用。本研究第一部分工作为了在三维构象水平进一步验证这一结果，我们建立了体外真核表达TCR-tg／82．Fe融合蛋白技术平台，并表达了TCR79／82(OT3)．Fc及其CDR380T3的V、D和J区随机突

3、变的三个突变体蛋白y9／f2(OT3)Vm．Fc、TCRy9／82(OT3)Dm．Fc和TCRy9／82(OT3)Jm．Fc，从而将CDR38放在一个完整的TCR结构中。在体外，通过流式细胞术、激光共聚焦扫描显微镜技术、免疫组化和ELISA的方法研究了TCRyg／152(OT3)．Fe及其突变体与肿瘤细胞、组织和抗原的结合情况。结果显示当V区和J区突变(Vm和Jm)后，TCRy9／82(OT3)．Fc与肿瘤细胞和组织的结合活性明显下降，而D区(Dm)突变下降的并不明显。这一结果与我们实验室前期结果一致。我们进一步证实了，CDR38的

4、侧翼序列是TCRy9／82与肿瘤抗原结合的关键区域这一推论。此外我们建立了利用昆虫杆状病毒表达系统表达TCRy9／82．Fc融合蛋白技术平台，并表达纯化了TCRy9／82(OT3)．Fc和其点突变融合蛋白TCRy9／82(OT3)CA．Fc和TCRy9／82(OT3)LA．Fc。通过激光共聚焦扫描显微镜技术和ELISA的方法检测了各融合蛋白与肿痛细胞和抗原的结合情况，结果显示，当V区的半胱氨酸(C)和J区的亮氨酸(L)突变后，融合蛋白与靶细胞和靶抗原的结合活性明显下降，这一结果提示我们，V区的半胱氨酸(C)和J区的亮氨酸(L)可能为

5、TCRY9／82(OT3)与肿瘤结合的关键点。北京协和医学院博f：研究牛论文根据TCRy9／{52可以识别多种肿瘤这一特点，结合目前抗体靶向治疗肿瘤所面临的靶向特异性有待进一步揭示的问题，我们提出了一个肿瘤靶向治疗的创新性策略：即将人类TcRY6识别肿瘤的特性通过基因工程的方法移植到一个基因工程抗体中。基于这一策略，在本研究上作的第二部分，我们根据小同需要设计并表达了i种肿瘤反应性TCRy9／82移植的人源化抗体／抗体片段，分别为TCRy9／82(OT3．)一Fe、TCRV62(OT3)一Fc和TCRV82(OT3)H／VY9L九。

6、通过流式细胞术、confocat免疫组化和ELISA等方法，比较了三种抗体／抗体片段与肿瘤细胞、组织和蛋白的结合活性。结果显示，TCRyg／f2(OT3．)-Fc与肿瘤抗原的结合活性最强，TCRV82(OT3)一Fc次之，TCRV82(OT3)H／Vy9LL与肿瘤抗原的结合活性最弱。继而，通过放射性同位素标记技术，对TCRY9／62(OT3．)一Fc和TCRV82(OT3)-Fc进行99mTc标记，并且观察了99mTe-TCRCg／82(OT3．)一Fc和99mTc．TCRV82(OT3)一Fc在荷SKOV3瘤裸鼠体内显像和分布情况

7、。体内外的实验结果显示，在这三种抗体／抗体片段中，TCRy’9／62(OT3．)一Fc抗体片段比较适于肿瘤的靶向治疗。最后，我们进一步观察了这种新型移植性抗体片段TCR—t，9／82(OT3．)一Fc抗肿瘤效果。体外实验显示，TCRyr9／82(OT3．),-Fc的加入可以增强中性粒细胞对SKOV3和Daudi的杀伤作用：SKOV3荷瘤裸鼠治疗实验显示，与PBS组相比，瘤周注射TCRy9／82(OT3．)--Fc组和TCRy9／82(OT3．)-Fc加中性粒细胞组，都明显抑制肿瘤的生长。综上，本研究初步论证了TCRy6移植性抗体用于

8、肿瘤靶向治疗的可行性，为肿瘤靶向性抗体治疗提供了新的线索和基础。综合两部分的实验结果，可以得到以下结论：1．CDR36的侧翼序列是TCR与肿瘤抗原结合的关键区域。2．CDR36序列中V区的半胱氨酸(C)和J区的亮氨酸(L)n--I能为