pvs-cp基因转化马铃薯的研究

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1、莱刚农学院硕士学位论文摘要PVS二CP基因转化马铃薯的研究摘要本研究以鲁引1号、夏波蒂、早大白、大西洋4个品种的微型薯为材料，建立了离体再生体系和转基因技术体系，并用PVs—cP基因转化马铃薯4个品种，获得了转基因植株。用脱毒微型薯获得的试管苗在2Ms液体培养基上经20天培养即可获得健壮的植株。选取健壮的试管苗在Ms+8％蔗糖与Ms大量元素+微量元素+肌醇+3mg／L6一BA的2种培养基上，经暗培养可以结出试管薯，为通过试管薯途径保存与交流转基因材料提供了方便。实验表明，鲁引1号、夏波蒂叶盘外植体在Ms+0．5mg／LNAA+4mg几6一BA培养基上可诱导出鲜绿色颗粒状、结构紧密

2、的愈伤，愈伤在MS+5mg／L6一BA+1mg／LzT培养基上可分化出不定芽，分化率分别为86．7％和93．3％。个品种的微型薯切块在MS+2mg／LI从+1mg／L6一BA+4mg／LzT+6mg／LKT的培养基上都可直接诱导出不定芽，鲁引1号的诱导率为63．3％，其他3个品种的诱导率均在90．0％以上。在Ms培养基上可顺利生根，形成完整的植株。用PVS—cP基因的上、下游引物及质粒pGEM—pvs为模板进行PcR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物为约900bp的特异条带。用ultrafree—DA试剂盒一步离心法回收特异扩增条带并与pGEM—TEasy载体连接，连接产物转化受体

3、菌DH5。【获得氨苄青霉素抗性菌落，经PcR及单、双酶切鉴定，筛选出了阳性克隆，其重组质粒命名为pGEM—pvsk。pGEM—pvsk经盖≯田I与占窖，Ⅱ双酶切后回收目的基因片段，植物表达载体pcambia一2300—35s一0cs经z却I与历蒯I双酶切后回收9Kb的片段。2个回收后的DNA片段连接后转化受体茵明5c【，经卡那霉素抗·陛筛选、质粒电泳检测、PcR扩增及肋aI的单酶切鉴定，筛选出了阳性克隆，其重组质粒命名为pcambia2300—pvsk。结果表明PVs—cP基因已定向插入到植物表达载体上，即获得了预期的PVs—cP基因的植物表达载体。该表达载体中PVs—cP基因受

4、caMV35s启动子的驱动，基因的3，末端是0cs终止子，在该质粒的T—DNA区除了PVs—cP基因外，还有NPTII基因。pcambia2300一pvsk转化农杆菌EHAl05，经卡那霉素与利福平抗性筛选、PcR扩增及肋aI单酶切鉴定，获得了预期的转化子EHAl05(pcambia2300一pvsk)。用农杆菌EHAl05(pcambia2300—pvsk)侵染马铃薯的叶盘和薯块外植体，经墨堕查堂堕堡主堂垡丝奎塑至卡那霉素抗性筛选获得了抗性不定芽及植株。4个品种的抗性植株经PcR检测都扩增出了900bp的目的基固片段，即获得了4个品种的转基因植株。关键词：马铃薯试管薯PVs—c

5、P基因农杆菌转基因植株II莱阳农学院硕士学位论文摘要Genetic7I’ransformationofPotatowithPVS．CPGeneABSTRACTVinlS。fkeminitLlberSoffourVarietieswereused．TheyareLuyin-l，Shepody’Zaodabaia11dAtIantic．ThepurposeoftheresearchistoestabIishregenerationsystemoffourpOtatovarieties加咖andintrOducePVS-CPgeneintothem．Plantletswe陀produc

6、ed开omVims—f沁em{nitubers．Vigorousplantletswereachievedafter20dcul岫intheliquid2MSmedium．MicotuberswereproducedfrOmthevigorousplantletsc山turedjnthemediumofMS+8％sucroseormediumofMSmaSselement+MSmicroelements+inositol+3mg／L6一BAindarkness．MicrotubersproVideconVenienceforpreservation锄dexchangeoftral

7、lsgenicpotatoes．LeafdiscexplantsofLuyin一1aIldshepodywereinoculatedintotbemediumofMs+0．5mg，LNAA+4mg几6-BA锄dcalluswereproducedsuccessfIllly．Adventitiousbudsweredif侥rcmiated丘DmthecalIusintIlemediumofMS+5mg几BA+lmg几ZT．111edi髓rentiationfrequenciesOf