pcrssp基因分型技术在红细胞血型鉴定中的应用的的研究

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1、摘要临床解决了一些疑难血型鉴定问题，在国内外输血医学实践中得到广泛应用。我国对ABO血型基因的研究自上世纪90年代中期开始，有关的实验室使用多重PCR、PCR-SSP、PCR-RFLP、序列测定、基因克隆和单倍体分型等技术对我国人群ABO基因遗传多态性进行了研究，发现了一些新的单核苷酸点突变，初步揭示出中国人群ABO等位基因有着自己的特点。由于各个实验室收集样本量的有限，均未能系统揭示出中国人群血型基因分子遗传的基础。本研究拟选取ABO、Rh、Kidd三个血型系统，建立适合本地区实际情况使用的PCR．SSP基因分型技术，调查基因频率，鉴定疑难血型；研究建立适合本地

2、区的RhD(．)个体鉴别、筛检策略。材料：随机选择134例样本参与A、B、O基因频率调查，其中再选择36份参与Jka、Jkb基因频率调查。样本来源为肇庆市2009年3月至4月的无偿献血者。疑难血型样本8例，RhD阴性样本2例，其血清学表型分别为Ccdee、ccdee，样本来源为肇庆市中心血站无偿献血者及肇庆地区各医院疑难血型及疑难配血送检样本。方法：(1)对134例献血者样本采用正、反定型试验进行ABO血型鉴定，同时采用PCRoSSP法进行基因分型实验；(2)对36份献血者样本采用抗人球蛋白方法检定其红细胞表面的Jka、Jkb抗原，同时采用PCR-SSP法进行基因

3、分型实验；(3)采用抗·D(IgM+IgG)在盐水介质中初筛，然后通过经典间接抗球蛋白试验(IAT)确认，筛检出2例I洫D阴性表型，使用PCR．SSP基因分型方法对2例I地D阴性表型样本进行Rh-C、c、D、E、e以及RhD外显子基因鉴定；(4)对8例ABO疑难血型样本采用正、反定型试验，吸收放散试验等进行血清学分型，采用PCR．SSP法进行基因分型实验；(5)统计学处理：用SPSSl3．0统计分析软件处理数据，ABO血型由计数方法得到的等位基因频率与Bemstrein公式得到的基因频率的比较采用拟合优度检验，P<0．05为差异有统计学意义。结果：(1)134名个

4、体血型基因分型结果均与血清学分型结果相符，在中国人群中小样本调查得出A、B、O等位基因的频率(计数方法)分别为20．15％、15．67％、64．18％，该数据与采用Bernstein公式求得A、B、O等位基因频率差硕士学位论文异无统计学意义(#=1．301，P--0．522)。Jka、Jkb基因的频率分别为Jka=0．4167(30／72)，Jkb=0．5833(42／72)。(2)PCR-SSP基因分型方法在鉴别RhD阳性以及真正意义上的RhD阴性个体中，与血清学结果相一致，但在鉴别血清学表型为Ccdee等C抗原阳性的个体时，基因分型结果与血清学结果出现不相符的

5、情况；(3)8例疑难血型样本仅凭血清学分型均难以确定血型。样本1与样本3经正定型均检不出A抗原，但吸收放散实验证实红细胞表面存在A抗原；样本2在显微镜下可见红细胞与抗一A有弱凝集，同时吸收放散实验证实红细胞存在A抗原；样本4与样本5存在意外抗体干扰反定型实验，血清学定型为A型；样本6红细胞与抗．A在肉眼下呈现凝集，但强度很弱，判定为A型：样本7在显微镜下仅见红细胞与抗．B有弱凝集，吸收放散实验证实红细胞表面存在B抗原；样本8经正定型检不出B抗原，吸收放散实验证实红细胞表面存在B抗原。基因分型试验显示，1至6号样本均为A／O，7、8号样本为B／O，基因分型所得的结果

6、与血清学分型结果相符合。结论：(1)选取ABO、Rh、Kidd三个血型系统为例子，建立了适合本地区实际使用的基因分型方法，小样本研究表明PCR-SSP基因分型方法能准确、有效对ABO、Rh、Kidd等血型进行正确定型。(2)建立了适合本地区实际使用的RhD阴性个体的鉴定策略。(3)应用PCR．SSP基因分型方法对ABO、Kidd血型系统进行了小样本基因频率调查，肇庆地区人群中A、B、O基因频率(计数方法)分别为20．15％、15．67％、64．18％，Jka、Jkb的频率分别为Jka=0．4167(30／72)，Jkb=0．5833(42／72)。由基因分型方法直

7、接检测等位基因再采用直接计算法得出的基因频率，与由观测表型再由Bemstein公式求出A、B、O基因频率差异无统计学意义(z2=1．301，P=0．522)。(4)研究了PCR．SSP基因分型方法在ABO疑难血型鉴定中的应用，能准确鉴定出疑难血型样本的血型。关键词：血型ABORhKidd血型鉴定PCR-SSPIII硕士学位论文ApplicationofPCR-SSPGenotyping。htentificationofRBloodin1entiliCaRedB100dCellGroupingName：ShangliangChenSuPervisor：Prof．Ch

8、engya