成年绒山羊皮肤干细胞的分离、纯化、鉴定和诱导

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1、摘要本研究旨在建立绒山羊皮肤干细胞的分离、纯化培养体系，并对其特性和分化潜能进行进一步探讨，以便为今后利用皮肤干细胞进行绒山羊毛囊的定向调控提供科学的理论依据。选择健康成年绒山羊背部皮样，经中性蛋白酶4℃消化过夜。分离表皮和毛囊。用胰酶消化后解离细胞，再用Ⅳ型胶原粘附法对消化细胞进行筛选分离，经IV型胶原粘附10min的绒山羊皮肤干细胞直径较小，核质比较大，培养过程中能够形成鸟巢状、岛状和铺路石状等不同形状的细胞克隆，而且在传代的过程中，大多数细胞始终维持在GI／G0期，各代克隆形成率也比较高，部分细胞表达K15、K19，p63、CD34和I)1--inte

2、grin，这些结果表明Ⅳ型胶原粘附筛选的细胞中包含有干细胞．在此基础上，进一步选择生长状态良好的Ⅳ型胶原秸附后的第二代皮肤细胞作为克隆纯化的对象细胞，利用96孔板有限稀释法获得了形态较为原始，直径约为101xm的单细胞，经传代培养，该细胞能够形成典型的全克隆；而且，随传代次数增加，大多数细胞仍处于GI／G0期，保持着干细胞的慢周期性，有较高的克隆形成率，始终具有较大的增殖潜能和克隆遗传力；各代细脆冷冻复苏率与24小时贴壁率差异不显著(p<0．05)；大多数细胞的K15、K19，p63、CD34和131．integrin等表面标志鉴定结果均呈阳性，分化标志K1

3、0和Involucrin检测结果呈阴性．在体外诱导实验中，这些纯化的于细胞能够被诱导生成神经元、神经胶质细胞、心肌细胞和成骨细胞，具有跨胚层分化潜能．以上结果充分证明了纯化的细胞就是绒山羊皮肤干细胞．此外，通过BI--integrin和CD34的FISH初步定位了绒山羊皮肤干细胞。其中．BI--integrin主要表达于绒山羊皮肤毛囊的外根鞘和毛乳头尖部，而CD34则主要表达于毛囊的外根鞘、毛乳头尖部和皮肤的基底层．关键词；成年绒山羊；皮肤干细胞；分离与纯化；鉴定；诱导Is(№PLⅡi】k五吣Id利洫确∞积Di似删h妯髓f搬碰0fStemCcllsfromA

4、dult‰C,oatSkin敝rac'tInthisstudy,weinvestigatedthecharacteristicsandtheavenuesofisolation,purification,identificationanddirectionalinducementofstemcellsfromadultcashmeregoatskin．11坞skinsampleofcashmeregoatWasincubatedinO．02％proteaseat4℃overnight,andtheepidermisandhairfolliclesWffres

5、eparated；thentheyw饿placedinasteriletubecontainingO．25％trypSinat37℃for30minandthedissociatedcellswereadheredwimcollagentypeIVtoculturedishesfor10rain．10minlater,theunattachedcellswereremovedandtherapidlyadherentepidermalcellswereculturedinstemcellgrowthmedium．Thecellsshowedalargenuc

6、lear：cytoplasmicratioandsmallsize．and眦formeddifferentshapesofclones．Thecellcycleprofilesfordifferentpassagessuggestedmostoftherapidlyadherentepidermalceilsarrested砒G1／GOphaseandtheyhadahigherproliferativepotential．Moreover,theisolatedcellsexpressedk15，k19，p63，CD34and131-Integrin．Th

7、eseresultsindicatedthattherewereepidermalstenlcellsinthepopulationoftherapidlyMherentepidermalcells．Then,asinglecellWasisolatedusing96-holecultureplatebydilutinglimitedlyatthesecondpassageoftherapidlyadherentepidermalcells。andculturedforasinglecellcloningandexpandedinstemcellmedium

8、．Theceilshadthestemcellcha