槲寄生凝集素功能域蛋白的研制与其生物学功能的初步研究

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1、上海交通大学医学院2007级硕士学位毕业论文能上调共刺激分子CD80的表达，诱导端粒的消失，导致染色体的不稳定。Wei等人发现肿瘤细胞K562，Molt-4,Raji细胞经槲寄生凝集素处理后能阻断癌细胞表面HSP70基因表达，出现典型的细胞凋亡，因此有报道提示MLs可作为高表达HSP[6,13-17]的肿瘤患者的化疗增敏剂。欧洲槲寄生提取物已经用作临床上癌症患者化疗佐剂,其中槲寄生凝集素(MLs)被认为是其中最主要的活性成分。通过p53,p21这条信号转导途径诱导SKHP-1和HeP3B细胞的凋亡,其作用机制是引起Bcl-2的下调及Bax的上调,同时伴有端粒酶活性的下降,引发胱天

2、蛋白酶(caspase)活化的级联链,从而引起凋亡。细胞凋亡的过程包括细胞的固缩，特异性胞浆大泡，染色质浓集，核破碎形成的凋亡小体等等。同时这种细胞凋亡完全依赖于细胞内Caspase的活化，它的作用能被一种Caspase广谱抑制剂：zVAD-fmk所抑制。在Fas启动的死亡信号传导中,Caspase-8是一种处于最上游的启动酶，能接受来自带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD(Fas-associatingproteinwithdeathdomain)下传的凋亡信号，随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶Caspase-8酶原发生同嗜性交联(homophilicinteraction)，如

3、图2所示。Caspase8单链酶被激活为具有活性的双链蛋白，进而引起随后的Caspase级联反应，发生细胞凋亡。Caspase-8启动酶的这种凋亡效应被认为受死亡受体包括CD95，TNF受体1以及图2：Caspase-8介导的细胞凋亡Science(1998)281:1305-13083上海交通大学医学院2007级硕士学位毕业论文[15,18,19]TRAIL受体的限制。我们猜测CD95可能参与了MLs诱导的凋亡导致caspase-8的活化。MLs可能通过上调细胞表面CD95L的表达，随后通过自分泌或旁分泌的机制发生CD95依赖的细胞凋亡；另外也有可能是MLs直接引发CD95死亡

4、受体的交联，这一点类似于ConA诱导的T细胞受体活化。为探讨CD95是否参与了MLs诱导的凋亡，我们采用CD95敏感的Jurkat和CD95抵抗的Jurkat-R细胞株，培养体系中加入不同浓度的MLs,两者均出现凋亡，并显示出了相似的剂量依赖性；而在上述两者中加入抗CD95单抗后，只有CD95敏感的Jurkat发生凋亡，提示了MLs诱导的是CD95非依赖的凋亡途径，且呈现时间和剂量依赖。如前所述，槲寄生凝集素是一种II型核糖体灭活蛋白，人们关注于它直接和间接的细胞毒作用之外，对它的免疫调节作用的研究也不断深入。而要发挥免疫调节作用，必须依赖于其B链与细胞表面糖基的结合，引发一系列

5、细胞反应而发挥效应。2+当MLs与细胞表面半乳糖或N-乙酰半乳糖胺结合后，促进Ca流动，启动蛋白质和[7,20]磷脂的磷酸化，促进了细胞内吞，进而介导A链进入胞内发挥细胞毒性作用。研究表明，只要细胞表面受体上有合适的糖基可供B链功能域结合，便可引发一系列免疫反应，不同的细胞对B链结合的敏感性也不同。经MLs诱导后，可以促进T、B细胞对有丝分裂原的敏感性；提高NK细胞和巨噬细胞的杀伤活性；提高经LPS刺激的巨噬细胞分泌IL-1，IL-6等细胞因子；具有免疫增强和增加免疫反应性的作[8]用等等。因此，对槲寄生凝集素B链的研究，对于了解其免疫调节功能具有更重[21]要的意义。已有文献报

6、道欧洲MLs的B链的组成结构，如图3所示：它由264个氨基酸残基组成，其中包括7个半胱氨酸残基和3个N-连接糖链。MLs的B链的氨基酸序列与其它类型半乳糖苷特异性凝集素具有高度同源性，如与蓖麻毒素和相思豆毒蛋白，分别具有169、146个相同的氨基酸残基，这对于研究MLs的B链具有非常重要的意义。基于课题组对槲寄生凝集素的研究工作，已经发现中国槲寄生具有欧洲和韩国槲寄生不同功效特性，藉此，我们通过传统的生化方法从中国槲寄生中提取纯化了4上海交通大学医学院2007级硕士学位毕业论文MLsP，对其生物学功能进行了分析。运用大肠杆菌克隆和表达了槲寄生凝集素B链，即功能域蛋白MLP，为进一

7、步生物学功能实验获得稳定、大量、AminoResidues均一的工程菌蛋白。acidnumbersDDVTCSASEPTVRIVGRNGMRVDVR25DDDFHDGNQIQLWPSKSNNDPNQLW50Asp19Asn20TIKRDGTIRSNGSCLTTYGYTAGVY75Thr22VMIFDCNTAVREATIWQIWDNGTII100Ser21Glu6NPRSNLVLAASSGIKGTTLTVQTLD125Gln14Pro10YTLGQGWLAGNDTAPREVTIYG