胆汁酸衍生物对大鼠免疫性肝纤维化的阻抑作用与机制探讨

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1、原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：日期：趔：上幺关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密

2、论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：导师签名：童故丘墅一日期：巡』：￡垄绛銎山东大学博士学位论文胆汁酸衍生物对大鼠免疫性肝纤维化的阻抑作用及机制探讨博士研究生梁铁军导师秦成勇中文摘要研究背景及目的：肝纤维化(hepaticfibrosis)是诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组织学改变，是影响慢性肝病预后的重要环节。其特征是以胶原为主的细胞外基质(extracellularmatrix，EcM)各成分因合成增多、降解相对不足而在肝内过量沉积。肝纤维化为一动态过程，属可逆性病变。但若进一步发展致肝小叶结构改建、假小叶形成(肝硬化阶段)则不可逆。迄今为止，临床上还缺乏公认的确

3、切有效的抗肝纤维化药物问世，肝纤维化的防治研究在今后一定时期内仍是国内外的热点与难点课题。胆汁酸衍生物——熊去氧胆酸(UDCA)是人机体内源性第三步合成的胆汁酸，能拮抗疏水性胆酸的细胞毒性作用，保护肝细胞膜：调节免疫功能；抑制细胞凋亡；清除自由基和抗氧化作用以及抑制炎症等作用。临床上对慢性肝病伴肝内胆汁淤积、原发性胆汁性肝硬化等疾病具有显著的疗效。有研究表明UDCA可能还具有抗肝纤维化的作用。为了进一步探讨其对肝纤·维化的影响，本实验采用了经典的实验性肝纤维化的动物造模方法一猪血清诱发肝纤维化，并选择秋水仙碱作为治疗参照药物，观察UDCA在动物整体环境下阻抑免疫损伤性肝纤维化的疗效；

4、进一步研究UDCA对TGFB1诱导肝星状细胞(HSC)增铕和l型胶原分泌的影响以及UDCA对TGFBI／Smad信号转导通路的影响，探讨UDCA阻抑肝纤维化的可能分子机理，为临床上防治肝纤维化提供初步的基础理论与动物实验依据。方法：1．Wister大鼠120只，雌雄各半，随机分成6组：肝纤维化模型组(B组)20只，给予猪血清腹腔注射，0．5ml／次，每周2次，持续12周，诱导大鼠肝纤维化；正常对照组(A组)20只，给予等量生理盐水腹腔注射；UDCA大中d,N量组(C、D、E组)各20只，猪血清处理同模型组，同时将UDCA(30mg·kg～·d～、山东大学博士学位论文15mg·kg一·

5、d一、7．5mg·k91·d-I)用普通饮用水配至成89／L、49／L、29／L的浓度，给大鼠自由饮用，持续12周；秋水仙碱组(F组)20只，猪血清处理同模型组，同时将秋水仙碱(O．1mg·kg。1·d。)用普通饮用水配成秋水仙碱水溶液，给大鼠自由饮用，持续12周。实验结束时称重后处死全部大鼠，剖开腹壁，观察大鼠肝脏和脾脏情况；采用HE染色法和Masson染色法观察大鼠肝组织病理形态改变及纤维化程度分级；随机抽取样本电镜下观察超微结构改变；用自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、T一谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆汁酸(TBA)和白蛋白(Alb)

6、指标；采用放射免疫分析法检测血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、IV型胶原(CIV)、111型前胶原(PCIH)；采用免疫组化法检测大鼠肝组织I型胶原、III型胶原、TGFB1表达，并用图像分柝半定量法检测其平均灰度值；逆转录——聚合酶链反应(RT—PCR)法检测肝组织I型胶原、III型胶原、TGFBlmRNA的表达，并用图像分析法计算其曲线下峰面积与GAPDHmRNA积分值之比值。2．用不同剂量(0．25、0．5、1．Ommol／L)的UDCA处理经5ng／mlTGFB1诱导的HSC—T624h及48h。MTT比色法检测UDCA对HSC—T6细胞增殖的影响：流式细胞术(FCM

7、)检测细胞周期分布；免疫细胞化学染色法检测各组细胞I型胶原、cyclinD，、cyclinE蛋白的表达；RT—PCR法检测各组细胞I型胶原mRNA的表达。3．用不同剂量(O．25、0．5、1．Ommol／L)的UDCA处理经5ng／m1TGFBl诱导的HSC-T624h及48h。以蛋白印迹法观察UDCA对TGFBlI型受体(T0RI)、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达的影响；RT—PcR法检测各组细胞Smad3、Smad7、CBPmRNA的表达。