骨髓干细胞移植治疗心肌梗死后心力衰竭的实验研究

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1、中文摘要骨髓干细胞移植治疗心肌梗死后心力衰竭的实验研究背景和目的充血性心力衰竭是心肌梗死后最严重的并发症，以往的治疗手段尚不能使受损的心肌细胞得到有效的修复。干细胞技术的研究发展表明，骨髓细胞移植有可能成为治疗这类病人的全新方法。但是，以往的研究应用的骨髓间充质细胞都是通过培养得到的，因此这种细胞仍存在纯度不高、表现不均一、不利于移植后的分化鉴定等缺点．因此有必要对供体细胞进行改建。供体细胞种类不同，引起的心功能改善程度也不一致，何者是移植的最佳供体细胞，目前并无比较研究。动物实验应用的供体细胞

2、多为人源骨髓干细胞，多为异种移植，这种异种移植是否会影响其疗效呢?供体干细胞的改建是影响骨髓干移植疗效的主要因素。但是，由于心脏自身的血流灌注状态对心梗后骨髓干细胞移植的疗效可能也有较大影响，改善供体所在微环境也可能是提高其疗效的关键。本研究旨在探讨：(1)从培养的人源骨髓问充质细胞分选、纯化、扩增得到纯化均一的多潜能间充质干细胞；(2)观察这些细胞移植在梗死心肌中对血管新生和心脏功能改善的效果：(3)与目前常用的其他供体细胞比较，观察经纯化的骨髓干细胞移植是否更有利于心脏功能改善：(4)通过观

3、察纯化的骨髓干细胞移植后引起缺血心肌中与排斥反应密切相关的基因HO一1表达情况，探讨HO—l与异种移植人源MMSCs到梗死大鼠心脏引起的效应之问相互关系：(5)通过观察梗死区侧枝循环的建立对冠脉内骨髓单个核细胞移植术心肌修复疗效的影响．探讨受体心脏微环境对供体细胞功能的影响。方法利用大鼠急性心肌梗死模型和小型猪慢性心肌缺血模型，通过心外膜直视下注射或经冠状动脉内注射方式移植骨髓干细胞。超声心动图检测心脏功能和结构的变化；冠脉造影显像评估侧枝循环情况；组织病理学显示心室胶原含量的变化；免疫组化法显

4、示新生血管数量、移植细胞的可塑性情况、宿主心肌血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)和归巢因子(SDF一1)的表达情况；RT—PCR、Real—timePCR和WeSterrlb10t检测这些细胞因子或细胞蛋白的mRNA和蛋白表达情况。结果第一部分内容，通过制备大鼠心肌梗死模型，采用通过细胞培养与流式分选双结合的方法，从培养的人源骨髓间充质细胞分选、纯化、扩增均一换多潜能间充质干细胞(MultipotentMesenchymalStemCelts，MMSCs)，同时对其特征

5、进行鉴定，分析其体外和在体的分化能力，观察这些细胞移植在梗死心肌中对血管新生和心脏功能改善的效果。结果表明：1．MMSCs阳性表达CD44、CD90和CDl47，阴性表达CD34、CD38、CD45、CD71、CDll7、CDl06和HLR—DR，并表达干细胞标志蛋白(Oct4，Binil和ABCG2)，分泌VEGF，5-aza可以诱导这些细胞向心肌细胞分化：而成纤维细胞虽然阳性表达CD44、CD90和CDl47，但并不表达Oct4，Bmil和ABCG2，不分泌VEGF，不能被5-aza诱导向心

6、肌细胞分化。2．与成纤维细胞移植或注射盐水组比较，移植MMSCs明显促进梗死心脏VEGF表达(mRNA和蛋白水平)，也显著增加缺血心肌血管新生。3．免疫荧光检测显示VEGF表达在移植的MMSCs和受体心肌细胞均表达。4．激光共聚焦显微镜显示移植的MMSCs在移植后14天表达心肌细胞和血管内皮细胞特征性蛋白。第二部分内容，应用磁珠分选和极限稀释细胞培养方法获取人源骨髓单克隆间充质干细胞(snMSCs)，利用贴壁培养方法得到未纯化的骨髓间充质细胞(uMSCs)，利用梯度密度离心法得到骨髓单个核细胞(

7、BMMNCs)和外周血单个核细胞(PBMNCs)。流式细胞仪分析所得细胞特性后，将其移植到梗死心脏。术后90天，应用血流动力学技术检测大鼠心脏功能，随后取材，免疫荧光检测移植细胞的分化情况和血管密度。结果显示：1．snMSCs呈99％以上表达间充质干细胞标记蛋白，阴性表达造血细胞标记蛋白。2．移植snMSCs心脏收缩功能较明显高于其它各组(P

8、(P