裂褶菌培养基形态学观察与致病性的动物试验的研究

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1、n”!。【E【目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5研究论文裂褶菌培养基形态学观察及致病性的动物实验研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11刖吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lI材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．19附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43讨论⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52综述侵袭性曲霉感染药物治疗的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯66个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯67中文摘要裂褶菌培养基形态学观察及致病性的动物试验研究摘要目的：裂褶菌(Sehizophyllumcommune)属真菌门，担子菌纲，伞菌目，裂褶菌科，裂褶菌属，广泛分布于世界各地。该菌多寄生于腐木上，是林木常见的

3、致病真菌。在对人类致病性方面，临床上以吸入其孢子引起过敏反应较为常见，而由该菌引起人体深部组织感染病例罕见，但近年来国外有关该菌引起人体深部组织感染的报道逐渐增多。本研究所用菌株分离自我科会诊病人的痰液，经中国科学院微生物研究所鉴定为SchizophyUumcommune。本研究一方面通过对裂褶菌在五种不同培养基上的形态学特征进行观察，寻找更适合其生长的培养基，为临床上诊断裂褶菌感染提供实验室依据；另一方面，采用动物实验的方法，将裂褶菌悬液分别经皮下、腹腔及静脉途径接种于不同免疫状态的小鼠体内，观察小鼠28天内的死亡率，并通过组织真菌逆培养、组织载菌

4、量测定及组织病理学等检查，比较不同免疫状态下小鼠心、肝、脾，肺和肾等主要脏器的感染程度，为进一步了解此菌的致病力及其引起的组织病理学改变提供实验室依据。方法：lDNA序列分析提取分离菌DNA，PCR扩增其26SrDNA近5，端D1／D2区域，在DNA自动测序仪上进行直接双向测序确定碱基位点，通过GellBanl(／EMBL／DDBJ核酸序列数据库进行同源序列检索，通过系统树显示其亲缘关系。2茵落形态学观察2．1五种平皿培养基上菌落大体形态学观察将我科保存菌株常温复苏3天，分别接种于沙堡氏琼脂培养基(SDA)，麦芽浸膏琼脂(MEA)、马铃薯葡萄糖琼脂(

5、PDA)，玉米粉琼脂(CMA)和察氏琼脂(CZA)上，’分别置于27"C和37。C恒温箱培养2周，观察菌落生长情况、测量菌落直径并绘制生长曲线。2．2小培养(方块法)将裂褶菌分别点种于以上五种培养基的小培养上，27℃和37"C恒温箱培养2周，观察菌丝生长、产孢情况。中文摘要2．3光镜观察取五种培养基生长良好的菌落标本置于载玻片上，经乳酸酚棉兰染色，光镜下观察。2．4扫描电镜观察取SDA培养基两个温度下培养7天的菌落标本，置于4％的戊二醛中固定，常规制片后在扫描电镜下观察。3生理学实验3．1尿素酶试验将菌落接种于尿素琼脂培养基上，室温培养l周，观察培养

6、基变色情况。3．2放线菌酮抑制试验将菌落分别接种于含有放线菌酮和不含放线菌酮的沙堡琼脂培养基上，27℃和37℃恒温箱培养2周，观察菌落生长情况。4动物的致病性试验4．1裂褶菌系统感染动物模型的制作将保存菌株复苏，转种于SDA培养基上37。C培养7天。用无菌生理盐水制备成菌悬液，通过皮下、腹腔、静脉三种途径接种至不同免疫状态的小鼠。4．2死亡率观察连续观察各组小鼠感染该菌后28天内的自然死亡情况，记录死亡日期和死亡只数。4．3感染内脏大体观察将不同感染时间的小鼠分批处死进行解剖，分别取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏，观察各脏器是否肿大或萎缩、有无颜色改

7、变等大体形态改变。4．4组织真菌逆培养无菌条件下将各脏器用组织研磨器研碎后挑取少许分别接种于含沙堡氏琼脂培养基的试管中，37*(2恒温箱培养一周，统计各组小鼠内脏逆培养阳性数。培养阳性的菌落分别移种至平皿培养基及小培养的培养基上培养，观察其菌落形态以及菌丝和孢子的形态。4．5脏器真菌载菌量测定无菌条件下取小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏，匀浆后分别进行组织的真菌平皿培养，计算各脏器的真菌载菌量。4．6组织病理学检查切取接种菌悬液小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等脏器，用10％福尔马林溶液固定，常规脱水、透明、包埋、切片，进行HE和PAS染色，光镜

8、下观察其组织病理学改变。结果：中文摘要lDNA序列分析结果基于26SrDNADI／D2区序列和Neighbo