大肠杆菌yead和人源rpe的初步晶体学的研究

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1、删mⅢⅢ674中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。签字日期：到f2：Q‘!!墨中国科学技术大学学位论文授权使用声明作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有

2、关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。嗣公开口保密(——年)作者签名：．熊灶查=导师签名：签字日期：学¨Ⅲ¨"摘要1．大肠杆菌YeaD的表达、纯化、结晶及其结构分析Leloirpathway是体内半乳糖代谢的主要途径，这个途径通过三个步骤将乳糖被B一半乳糖苷酶分解产生的B一半乳糖转变成葡萄糖一卜磷酸，葡萄糖一卜磷酸又可通过葡萄糖磷酸变构酶转变成葡萄糖一6一磷酸，从而进入糖酵解途径。半乳糖变旋酶是Leloi

3、rpathway途径的第一个酶，它的功能就是把B一半乳糖转变成Q一半乳糖，而后者才能通过Leloirpathway最终转变成葡萄糖一卜磷酸。大肠杆菌YeaD是半乳糖变旋酶超家族的成员，虽然该家族成员的催化活性中心相同，但底物结合口袋存在差异，YeaD的结构解析及其结构与功能关系分析将为揭示YeaD的作用机制提供重要的结构基础。我们通过PCR的方法从大肠杆菌的基因组中获得了目的蛋白基因，并且把它构建到PET22B质粒中。重组蛋白被转化到EscherichiacoliBL21(DE3)菌株中表达，目的蛋白通过Ni亲和柱和分子

4、筛的纯化后可达到95％以上的纯度。在经脱盐和浓缩后进行晶体生长。采用悬滴气相扩散法在287K下进行晶体生长实验，最终获得了1．9A分辨率的晶体，并收集了晶体衍射数据。衍射数据经HKL一2000处理得到如下结果：晶体空间群P2。2。2。，晶胞参数为a：64．72A，b：97．32A，c=106．99A，一个晶体学不对称单位含2个分子，利用分子置换获得了晶体的初步相位，结构解析工作正在进行中。关键词：YeaDLeloirpathway半乳糖变旋酶大肠杆菌半乳糖变旋酶超家族X-ray衍射晶体结构2．D一核酮糖一5一磷酸一3一异

5、构酶的表达，纯化以及初步晶体学研究磷酸戊糖途径是体内葡萄糖代谢的一条支路，分为氧化和非氧化两个部分，非氧化部分的功能是在核酮糖-5-磷酸的基础上通过一系列基团转移反应，将核糖转变成果糖一6一磷酸和甘油醛-3-磷酸而进入糖酵解途径。D一核酮糖一5一磷酸一3一异构酶(RPE)的功能是通过转变碳骨架的立体化学构象来实现D一核酮糖一5一磷酸和D一木酮糖一5一磷酸之间的互变，而D一核酮糖一5一磷酸和D一木酮糖一5一磷酸的互变是细胞内的戊糖磷酸途径中非氧化途径的第一步反应，我们从人脑的cDNA文库中克隆了RPE蛋白的基因，并在大肠杆

6、菌表达并纯化了人源RPE蛋白。在纯化人源RPE蛋白过程中，我们意外发现它无法像其它同源重组蛋白那样通过Ni亲和柱来纯化，因为它遇到Ni离子会立刻变成沉淀，这个现象也同时发生在含有zn离子和Mg离子的情况，但是这些沉淀可以用EDTA重悬，重悬的蛋白经过离子交换柱纯化后可以获得稳定的蛋白同二聚体。为了进摘要一步确认这个现象和重组蛋白上所带的HIStag之间的关系，我们构建了一组质粒，分别为N端带HIStag，C端带HIStag，两端都带HIStag和不带HIStag四种，结果发现N端无HIStag的重组蛋白在大肠杆菌的表达系

7、统里都形成了包涵体，只有N端带有HIStag的才能在表达后获得可溶蛋白。纯化的RPE蛋白采用悬滴气相扩散法在287K下生长7天获得晶体，晶体脱水后通过X—ray衍射获得了分辨率2．3A的晶体结构。晶体衍射数据用HKL2000处理得到如下结果：空间群是P2。，晶胞参数：a=64．18A，b=130．78A，c兰66．ooh，B=113．40。，一个不对称单位含4个分子。利用分子置换获得了晶体的初步相位，结构解析工作正在进行中。蛋白中结合的金属原子利用原子吸收光谱进行了定量检测。关键词：磷酸戊糖途径同源蛋白重组蛋白X-ray

8、衍射晶体结构原子吸收光鞫丘p日—’it一-1F■矿。__!⋯Abstract1。Clonging，expressing，purification，Crystallizationandstructureanalysisoftheputativealdose1-epimeraseYeaDfromEscherichiaco