pylbcd和lr蛋白的初步晶体学研究

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1、目录3．1．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．1．2表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．1．3目的蛋白的表达、纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。333。1．4晶体的筛选、优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．2结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．363．2．1LR蛋白的初步纯化、结晶⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363．2．2LR蛋白的酶解处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．

2、383．2．3使用不同去垢剂得到的蛋白晶体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42第四章总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。444．1课题研究成果总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯444．2工作中待解决的问题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．44参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．49IV1．1吡略赖氨酸合成酶1．1．1引言第l章绪论第1章绪论在自然界中，大多数蛋白

3、质是通过核糖体合成的。mRNA含有遗传密码的信息，指导特定氨基酸序列多肽链的合成。氨基酸共价的与转运RNA(tRNA)形成氨酰．tRNA(aa．tRNA)，tRNA上有反密码子，可以识别mRNA上的密码子，在核糖体的作用下，氨酰．tRNA结合到mRNA上，经翻译形成多肽，进而形成蛋白质。在这个过程中，氨酰一tRNA的正确合成是很重要的。氨酰．tRNA的合成是由氨酰．tRNA合成酶催化的，每种氨酰．tRNA合成酶只利用相应的tRNA和氨基酸合成氨酰．tRNA(Ibbaetal，2000)。在自然界存在的蛋白中已经发现了180余种不同的氨基酸，但是它们中

4、的大多数是由20种基本氨基酸的翻译后修饰形成的。每个密码子均对应这20种氨基酸中的某一种(或终止翻译)。但是近些年的研究发现，在一些生物中，某些终止密码子可以翻译成为硒代胱氨酸(Soiletal，1988)或者吡咯赖氨酸(Haoetal，2002)1462。463，因此这两种氨基酸也分别被称为第21种和第22种氨基酸。在大多数情况下，终止密码子可以终止mRNA的翻译，但在一些特殊情况下(例如抑制基因突变)，终止密码子可以被特殊的tRNA识别，从而正常翻译，继续多肽链的合成。在一些情况下，终止密码子被翻译成20种基本氨基酸的一种，但在某些生物中，终止密

5、码子被翻译成特殊的氨基酸。在一些古细菌中，终止密码子UGA编码硒代胱氨酸，可以被相应的tRNA(tRNA融)识别。而在一些甲烷八叠球菌科的古细菌中，终止密码子UAG可以被相应的tRNA识别，翻译成吡咯赖氨酸。在这种情况下，相应的tRNA，吡咯赖氨酸(Pyrrolysine，Pyl)和吡咯赖氨酰一tRNA合成酶(PyIRS)是必需的(Polycarpoetal，2004)。1．1．2吡咯赖氨酸的发现产甲烷菌是一类厌氧古细菌，可以利用二氧化碳和氢化物产生甲烷。甲烷八叠球菌科(Methanosarcinaceae)是产甲烷菌中的一种，其特点是能利用甲胺类第

6、1章绪论合成甲烷(Booneeta1．1993)。从一甲胺产生甲烷的过程需要一种一甲胺甲基转移酶的参与，在编码该种酶的mtmBl基因中有一个UAG密码子，该密码予被IF常翻译才能形成完整的具有正常功能的甲基转移酶MtmB(Krzyckietal，2004)。Methanosarcinabarkeri中的MtmB品体学结构显示UAG编码的是￡一氨基上连有吡咯环的氨基酸，即吡咯赖氨酸，该位置的吡咯赖氨酸对酶催化反应具有重要作用。如图1．1所示，吡咯赖氨酸往底物口袋中的活性位点中。在催化反应中，MtmB与MtmC形成复合物共同作用，MtmB协助。甲胺的甲基

7、基Ijl转移到MtmC的类咕啉辅因子卜．。其中MtmB中的吡咯赖氨酸将‘甲胺的甲基基团同定并使其处丁．合适的位置，使其有利于类咕啉辅因子攻击。NH√＼八pO。HIONH2Pyrrolysine(Pyl，1)图1．1MtmB和吡咯赖氨酸的结构fHertweck，2011J1．1．3吡咯赖氨酸的生物合成近来的研究发现，‘些甲烷八叠球菌中吡咯赖氨酸的合成及连接到相应tRNA1-．的过程与一个基因簇有关，该基因簇位于MtmB编码基因附近，称之为pylTSBCD(Srinivasanetal，2002)。其中pylTU爿EtRNA971(也称为tRNACUA)

8、，识别mRNA上的UAG密码子，pylS编码吡咯赖氨酰一tRNA合成酶2第l章绪论(pyrrolysyl—t