远红外荧光蛋白smurfp的初步晶体学研究

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1、远红外荧光蛋白smURFP的初步晶体学研究PreliminaryCrystallographicStudyofafar-redfluorescentproteinsmURFP专业：生物学作者姓名：王飞指导教师：饶子和院士杨海涛教授天津大学生命科学学院二零一七年五月万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位

2、论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据摘要1962年下村修等人分离得到的绿色荧光蛋白及其各种突变体在生物科学研究中主要用于标记和示踪。但是绿色荧光蛋白发射光谱仅仅局限在440-529nm，细胞内成像时背景高，应用于活体生物的

3、标记和示踪效果不够好。在1999年首次报道的红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白相比其优点非常明显。而本论文中所研究的远红外红色荧光蛋白能够很好的解决生物体内成像背景高的问题。2016年ErikARodriguez等人用TeAPCα经过突变产生了符合要求远红外红色荧光蛋白smURFP。突变体smURFP不仅亮度高而且能够在642-670nm范围内激发荧光，满足用于生物体内研究的需求。如何了解该蛋白质发光的结构机制，并利用其生化特性改造、设计新一代远红外红色荧光蛋白具有重要的科学价值和应用前景。而本文将smURFP作为研究对象，通过分子克隆等手段成功构建了一系列克隆，并在大肠杆菌中实现了目

4、的蛋白进行了过量表达。通过亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等手段对目的蛋白进行了纯化，并获得了纯度较高的smURFP蛋白。通过对结晶条件的筛选我们获得了smURFP蛋白结晶。经过pH优化、添加剂优化等过程最终得到高质量的蛋白质单晶，并在上海同步辐射光源进行数据收集。虽然母体smURFP蛋白晶体衍射达到2.1Å，在结构解析过程中利用分子置换法仍无法确定晶体相位。为了解决相位问题，我们后续对smURFP蛋白进行硒代甲硫氨酸标记，拟采用单/多波长反常散射的方式确定相位。在smURFP蛋白中有4个甲硫氨酸(除去起始的甲硫氨酸)，通过硒标蛋白的制备和纯化，我们得到了的纯度较高的硒代甲

5、硫氨酸标记的目的蛋白，并已获得较好的晶体。以上对smURFP蛋白的初步晶体学研究，有助于我们为后续解析其蛋白结构、了解其发光机制、进一步改造该荧光蛋白奠定了基础。关键词：红色荧光蛋白，smURFP，发色团I万方数据II万方数据ABSTRACTIn1962OsamuShimomuraandhisteamfoundandisolatedthegreenfluorescentproteinfromAequoreavictoriajellyfish.Greenfluorescentproteinanditsvariousmutantsareusedinbiomedicalresearc

6、hprimarilyforlabelingandtracing.However,sincetheemissionspectrumofgreenfluorescentproteinislimitedto440-529nm,thebackgroundishighinintracellularimaging,andthelabelingandtracereffectappliedtolivingcreaturesareunsatisfactory.In1999,redfluorescentproteinwasfirstreported,andit’sadvantagewasobvio

7、uscomparedwithgreenfluorescentprotein.Andthefarinfraredredfluorescentproteinstudiedinthispapercanbeagoodsolutiontotheproblemofhighimagingbackgroundinvivo.In2016ErikARodriguezetal.Producedanewfar-infraredfluorescentproteinnamedsmURFP.ThemutantsmURFP