成体骨髓干细胞在肾小管上皮细胞再生与损伤修复中的作用

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1、成体骨髓干细胞在肾小管上皮细胞再生及损伤修复中的作用中山大学博士学位论文成体骨髓干细胞在肾小管上皮细胞再生及损伤修复中的作用博士研究生：刘翔导师：余学清教授中山大学附属第一医院肾内科中文摘要急性肾功能衰竭是多种不同原因引起的肾功能急剧下降的综合征。在临床实践中，由于摄入有毒的物质或一些肾毒性药物引起的急性肾小管损伤是导致急性肾功能衰竭(ARF)的常见原因。虽然许多药物和生长因子已被证实对某些动物的ARF有效，但是近几十年来，并没有明显有效的新治疗方法在临床上应用。对成体干细胞的研究是近几年的热点，这类细胞具有多向分化潜能。研究发现成体骨髓干细胞

2、(BMSC)不仅能分化为造血细胞，也能分化为多种非造血组织的细胞类型。骨髓内的干细胞包括两种：造血干细胞(HSCs)和间质干细胞(MSCs)。多项研究表明，HSCs和MSCs均具有多向分化潜能。其中。MSCs由于具有易于获取、体外增殖能力强且性能稳定、低免疫原性等特点，使其在再生医学的应用中具有突出的优势。已有研究证实肾脏固有细胞，像系膜细胞、小管上皮细胞、足细胞等都可来源于骨髓干细胞。目前，在动物和临床研究中，用MSCs治疗一些损伤性、慢性、先天性、或免疫排斥性疾病都取得了很好的效果。本实验利用骨髓移植和肾脏移植两种模型，观察骨髓中的干细胞和

3、循环中的干细胞，在正常肾脏组织中，有无参与肾小管上皮细胞的更新、再生，进而为成体骨髓干细胞在肾脏疾病中的应用奠定基础。鉴于MSCs的临床应用潜能，我们观察了MSCs对氯化汞导致的大鼠急性l肾小管损伤有无治疗作用，并探讨了其肾脏保护作用的可能机制。成体骨髓干细胞在肾小管上皮细胞再生及损伤修复中的作用中山大学博士学位论文第一章成体骨髓干细胞在肾小管上皮细胞再生中的作用一、材料和方法1．骨髓移植模型选用18只体重2009左右雄性F344大白鼠，水合氯醛麻醉后，取其双侧股骨、胫骨，将骨的两端剪开，用5ml注射器吸取2ml生理盐水，反复几次冲出骨髓腔中的

4、细胞，细胞接着通过200目的钢丝网，制成单细胞悬液，计数，每只雌鼠大约移植5×107个骨髓有核细胞，悬浮于0．5ml的生理盐水中，尾静脉注入全身经C060一Y射线lOGray致死性照射的雌性大鼠中。在照射后6小时内注入骨髓细胞。2周(n=6)、8周(n=6)、14周(n=6)取肾脏标本。2．肾脏移植模型另选28只200--2509的F344大白鼠，雌雄各半。将雌鼠的左肾原位移植给雄鼠。2周(n=4)、8周(n=4)、14周(n=6)取移植肾脏标本。3．HE染色和激光显微切割肾脏石蜡组织块切成8pM厚切片，捞片于裱有膜的切片上，进行常规HE染色。

5、激光显微切割在20×物镜下，选择肾小管上皮细胞切割，切割下来的细胞在重力作用下落至下方的0．2ml离心管盖内，每个标本大约有2～3×1酽个细胞被切下。4．DNA的提取和PCR反应提取激光切割下来的细胞的DNA，用PCR方法检测细胞中有无Sry基因。二、结果1．DNA的提取从激光切割下的细胞中提取的DNA的浓度大约是10—30ug／ml，吸光度260／280nm>1．80，体积大约为20—30ul。2．Sry基因的检测在两种模型8周、】4周所取标本中，大部分可扩增出Sry基因特异性的条带；而两种模型2周的标本均未见Sry基因的存在。三、小结1．成

6、体骨髓干细胞可能是肾小管上皮细胞再生的一个来源。成体骨髓干细胞在肾小管上皮细胞再生及损伤修复中的作用中由大学博士学位论文第二章骨髓间质干细胞对肾小管损伤的修复作用一、材料和方法1屑髓MSCs的原代培养及诱导分化取Fischer344雄性大鼠，6～8周龄，颈椎脱臼处死后，取骨髓细胞过程同前。用含10％胎牛血清的L．DMEM培养基悬浮骨髓细胞，继而接种于25cm2的塑料培养瓶中，密度为每瓶2×107个细胞，3天后更换培养液，贴壁细胞即为MSCs。待MSCs传至第五代以后时，分别用成骨和成脂细胞诱导液诱导MSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化，以确定它们的

7、多向分化潜能。2．急性肾衰竭模型的建立及动物分组大鼠急性肾衰竭模型的建立采用腹腔注射HgCl2的方法，剂量为2mg／kg。SD雌性大鼠分为3组：MSCs组(Hgcl2／MSCs)，n=10，腹腔注射HgCl24～6小时后，每只大鼠约输注4X106个干细胞；Saline组(Hgclz／Saline)，n=10，使用无菌生理盐水代替治疗组的MSCs。另取3只正常雌性大鼠作为正常对照组。细胞及生理盐水均通过尾静脉输注。7天后，取材进行分析。3。组织学和肾脏病理损害的评分肾组织石蜡切片2lIm厚，行HE和PAS染色。对肾小管损害程度采用百分比评分法进行

8、评估，计算20个显微镜高倍视野(×400，HPF)肾皮质及外髓中发生损害(肾小管扩张、萎缩、管型、细胞脱落、坏死或小管炎)的肾小管数目和总肾小管数，以